[发明专利]一种痰液标本匀质化方法及使用的试剂

说明书

技术领域

本发明涉及用于临床痰液标本处理的一种痰液标本匀质化方法及使用的试剂，其可有效的匀质化痰液，同时保护痰液中包括军团菌在内的菌不受损伤，有利于对痰液样本的进一步分析。

背景技术

呼吸道疾病检查中采用自然咳痰法和吸痰法收集痰液标本获取的痰液标本具有明显的非均质性，细菌等成分的分布很不均匀，一般需要使用痰消化液将标本匀质化。随着检查精确度和实验质量控制要求的提高，标本的前处理受到越来越多的重视，根据日常工作观察，痰标本培养结果和与实际临床符合率仍然不理想，经常出现无法检测到痰液中的实际致病菌而误导临床诊治的情况。

目前，国内外对临床痰标本细菌分离培养所使用的商品痰消化液主要是由英国OXOID公司生产Sputasol(Liquid)SR0233，其成分包括二硫苏糖醇、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等。此外，实际临床检测或者实验中还有使用胰蛋白酶、糜蛋白酶等消化痰液的做法。中国专利申请201110126201.2号提供了一种适用于军团菌的痰消化液，其在Sputasol(Liquid)SR0233的基础上以钾盐代替钠盐，并加入EDTA，以避免钠离子和重金属离子对军团菌和其他菌的毒性并增强匀质化效果。中国专利申请201510031792.3则使用N-乙酰基-L半胱氨酸，三乙醇胺，胰蛋白酶来消化痰液，更好的保护痰液中的微生物。

虽然已经有上述痰消化液和消化方法用于痰标本的检测，但临床实践结果表明，这些消化液的匀质化性能和保护样本中菌(特别是某些在外界环境中较易失活的菌，如军团菌)的能力仍有欠缺。而且二硫苏糖醇成分稳定性差，试剂保存时间较短。

发明内容

发明人经过比对和筛选试验设计了一种痰液标本匀质化方法及使用的试剂，以较低浓度的TCEP盐酸盐(三(2-酰乙基)膦盐酸盐)和胰蛋白酶组合来裂解痰液中的粘性蛋白质，并辅以生物表面活性剂/螯合剂鼠李糖脂来消除金属离子对菌的不良影响并增强消化效果，可以在保证对包括军团菌在内的菌低损害的同时取得良好的匀质化效果。

一方面，本发明提供了一种痰消化液，其成分包括TCEP盐酸盐。

进一步地，该痰消化液由下列成分组成：

再进一步地，该痰消化液由下列成分组成：

另一方面，本发明提供了本发明的痰消化液在制备临床痰液标本检测试剂盒的应用。

另一方面，本发明还提供了一种痰液标本匀质化方法，使用本发明提供的痰消化液处理痰液标本。

具体实施方式

实施例1本发明的痰消化液和对照痰消化液的配制与使用

本发明的痰消化液的配制

按照下列成分列表配制本发明的痰消化液：

各种试剂均为国产分析纯，来自国药集团、诩圣生物等

将配制出的痰消化液分装为15ml/份保存在4℃冰箱中。使用时，每份贮加无菌水50ml配制成工作液。向痰液中加大致等量工作液，37℃水浴中消化15分钟，10000rpm/min，离心5min，即可取沉淀物供细菌培养或用作DNA提取使用。

实施例2与现有痰消化液消化效果比较

市售Sputasol(Liquid)SR0233(OXOID)，使用方法按说明。

消化液1：中国专利申请201110126201.2号实施例1中的痰消化液，使用方法按该申请说明书中的记载。

消化液2：中国专利申请201510031792.3号实施例1中的痰消化液，使用方法按该申请说明书中的记载。

2.1匀质化效果

取吸痰样品1份(体积约40ml)，分为4等份，分别以200ml无菌生理盐水洗涤3次以去除痰液表面的呼吸道正常菌群。按照实施例1中所述方法以及Sputasol(Liquid)SR0233(OXOID)、中国专利申请201110126201.2号、中国专利申请201510031792.3号记载的方法消化痰液。每种消化的痰液被分为9等份接种于血平板、麦康凯平板和巧克力平板上(每种平板3份)，置于35℃CO₂温箱中培养。3日后通过菌落形态和镜检来区分菌种类，记录每份痰液在三种平板上培养出的菌种类数。结果如下：

可见经本发明的痰消化液消化的痰液标本中，而且各份中菌种类数较为接近，大部分处于3种的区间内，而且检出菌种数量最多(29种)，明显好于其他几种痰消化液。

2.2对标本中菌的保护效果