[发明专利]腈水解酶突变体及其编码基因和应用

说明书

本发明涉及一种腈水解酶突变体，特别涉及一种腈水解酶突变体及其编码基因，以及其在制备光学活性2‑芳基丙酸中的应用。所述突变体包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸取代，所述位点为135、41、192、120。该突变体与野生型腈水解酶相比具有更高的酶活和/或立体选择性，该腈水解酶突变体在制备光学活性2‑APA中的应用，较化学合成法，能够降低生产成本，提高生产效率，适应工业化生产的需求。

技术领域

本发明涉及一种腈水解酶突变体，特别涉及一种腈水解酶突变体及其编码基因，以及其在制备光学活性2-芳基丙酸中的应用。

背景技术

在有机合成中，氰基易作为“水稳定负碳离子”引入有机化合物，而腈类化合物则是一种多用途的中间体，能转化为胺、酰胺、羧酸和羧基化合物等。用微生物酶水解腈为酰胺和羧酸时，由于反应条件温和以及高纯度的产物使之成为一种备受关注的方法，迄今在工业生产上已有许多成功的例子。近年来，颇有意义的是研究用微生物酶立体选择性水解腈类制备光学活性2-芳基丙酸(2-APA)，光学活性2-APA可作为药物活性基质，特别是作为非甾体抗炎药(NSAID)应用。由于药理临床的研究表明2-APA类的NSAID的对映体中只有右旋的构型显示高的药理活性，左旋构型活性低或无作用。鉴于一般化学反应所产生的手性中心总是得到等量的一对对映体混合物，称之为外消旋体。欲得到光学纯右旋2-APA，拆分外消旋体是主要方法之一。一般来说采用化学拆分需用手性衍生试剂，价格昂贵，且过程冗长，较难得到满意的结果。而用微生物酶法拆分则可提供一个经济的选择。

酮洛芬(Ketoprofen，KP)又名酮基布洛芬、苯酮苯丙酸、优布芬、优洛芬或Profenid，化学名为α-甲基-3-苯甲酰基苯乙酸，是由法国化学家Farge、Messer和Moutounier于1967年开发的优良的2-芳基丙酸类非甾体抗炎镇痛药物。其作用机制主要是通过抑制体内环氧合酶(COXs)、脂氧化酶(LOXs)的生物活性，从而抑制致炎物质前列腺素(PGs)、白三烯(LTs)的合成，具有对抗缓激肽释放、清除羟自由基以及稳定溶酶体膜活性，从而产生良好的解热、镇痛和抗炎作用，并增强其外周止痛效果。临床研究表明，酮洛芬作为重要的非甾体抗炎药物，与同类药物相比，具有剂量小、疗效高、耐受性好和毒副作用轻微等显著优点，成为治疗类风湿性关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎、强硬性脊椎炎以及痛风的理想药物，广泛适用于治疗痛经、牙痛、术后疼痛、癌性疼痛和神经炎、红斑狼疮、咽喉及支气管炎等疾病，对软组织受伤的治疗效果更好。

酮洛芬是2-芳基丙酸类非甾体抗炎药(NSAIDs)，只有右旋体才具有抗炎抗风湿和镇痛作用，左旋体几乎没有药理活性。酮洛芬的主要生产企业，国外除法国Rhone-Poulenc公司外，还有德国Sanofi-Aventis、意大利SIMS、Cosma和BidaChem、印度BEC Chemicals等公司；国内西南合成制药股份有限公司(原西南合成制药厂)、中国科学院上海药物研究所实验药厂较早开展了酮洛芬的产品研制和工艺开发工作。目前化学合成酮洛芬的工艺路线已非常成熟，但是合成的酮洛芬缺乏手型选择性。由于左旋酮洛芬没有药理活性，并且有很大副作用。因此，直接合成右旋酮洛芬或者将左旋酮洛芬转变成右旋酮洛芬都具有巨大的经济效益。

定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。体外定点突变技术是当前生物、医学各领域研究中的一种重要实验手段，是改造、优化基因的便捷方案，是探索启动子调节位点的有效手段，也是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具。定点突变改造粪产碱菌腈水解酶的研究具有极佳的理论和应用价值。

发明内容

本发明的目的是通过定点突变的方法对粪产碱菌腈水解酶基因进行改造，使改造后的基因工程腈水解酶在酶活和手性选择性方面有所提高，使其符合在催化生产右旋2-芳基丙酸工业化应用的需求。