[发明专利]一种生产埃博霉素B的方法

说明书

本发明具体公开了一种生产埃博霉素B的发酵方法，属于生物发酵领域。该方法在种子罐培养过程中流加氨水调节pH，得到大量种子菌体；在发酵过程中流加氨水或丙酸来调控pH，使得埃博霉素B的产量提高，简化了调控流程，降低了生产成本，利于工业化生产，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种生产埃博霉素B的方法。

背景技术

埃博霉素(epothilones)是1993年在黏细菌纤维堆囊菌Sorangium cellulosum的次级代谢产物中发现的，其结构为大环内酯类化合物。抗肿瘤作用机理与紫杉醇相似，具有抑制微管解聚的作用，相比之下，埃博霉素的水溶性更好，并且对多重耐药肿瘤细胞和耐紫杉醇的肿瘤细胞都表现出强大的抗癌活性，也没有紫杉醇临床应用中的粒细胞减少症、外周神经病变、脱发、过敏等严重副作用。因此，开发埃博霉素类化合物具有临床价值和社会意义。2007年，埃博霉素类B的衍生物伊沙匹隆在美国批准上市，激发了人们对埃博霉素类化合物研究的热潮，现已有六种埃博霉素类化合物进入了临床研究阶段。

目前，埃博霉素全合成步骤大都在20步以上，无法满足生产规模；而大规模发酵生产又存在诸多困难：埃博霉素的产生菌纤维堆囊菌的代时较长，生长速度非常缓慢，营养摄取率很低，氧的消耗比较少，发酵周期长，发酵时细胞浓度较低。因此，如何使纤维堆囊菌迅速生长，并提高埃博霉素的产量，减少主要杂质的含量，降低生产成本成为目前埃博霉素B研究的一个重要课题。

现有文献，有报道通过优化菌株提高埃博霉素B产量的方法，但对于纤维堆囊菌ATCC25532的发酵培养方法报道不多。经研究，中国专利CN103937851A、CN103045675A、CN103772407A和CN103788105A发酵效价均低于52mg/L。现有技术发酵方法仍然无法满足大生产的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种埃博霉素B的发酵生产工艺，克服了埃博霉素B现有生产技术的不足，加速了菌体生长，提高了埃博霉素B的产量，减少了主要杂质埃博霉素A的含量，利于后期纯化，降低了生产成本。

本发明提供的发酵生产工艺具体包括种子培养和发酵培养方法。所述的埃博霉素B生产菌为纤维堆囊菌ATCC25532。

埃博霉素B的培养方法具体包括以下步骤：

1)固体平板培养：菌种涂布于固体平板培养基上，30℃培养6-7天；

2)摇瓶扩培：平板接种于摇瓶中，30℃，200rpm培养4-5天；

3)种子罐培养：将摇瓶接种于种子罐中，30℃培养，转速为200rpm，通气量为0.5vvm，罐压为0.04kg/cm2，并流加酸碱调节剂使pH维持在7.2，当溶氧下降缓慢时，进行移种；

4)发酵罐培养：利用压差法将种子液接入到发酵罐中，接种量为10％的体积比，30℃，200rpm培养，空气流量为0.5vvm，维持在50％附近；发酵过程中加入酸碱调节剂维持pH值在7.2，在发酵48小时加入大孔树脂XAD-16N，发酵96小时开始测定效价。

优选地，所述步骤3)种子罐酸碱调节剂为氨水。

优选地，所述步骤4)发酵罐酸碱调节剂为氨水和丙酸。

优选地，所述步骤3)种子罐和步骤4)发酵罐酸碱调节剂的配置浓度为20％-30％，121℃灭菌20min使用。

优选地，所述步骤4)发酵罐采用流加方式进行pH自动控制，前期补入氨水，后期补入丙酸。

优选地，所述步骤1)固体平板培养的培养基成份为，葡萄糖0.1％、蛋白胨0.2％、硫酸镁0.1％、氯化钙0.2％、磷酸氢二钾0.2％、酵母提取物0.3％。调节pH至7.2。