[发明专利]一种DNA片段与载体的高效连接方法及其应用与试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及DNA组装技术，具体地说，涉及一种双链DNA分子片段与克隆载体的高效连接方法。

背景技术

在基因工程和蛋白质工程中，对目的基因功能的研究是一个重要方向：一是确定其表达调控机制和生物学功能；二是建立高效表达系统进行体外基因功能表达，例如抗体工程；三是将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，包括人体基因治疗；或者其他一些方面。在这些研究中，常常需要获得大量的目的基因，基因克隆重组是实现这一研究目的的重要基础技术。而目的基因DNA分子片段与克隆载体连接是基因克隆重组重要环节之一。

在科研实验过程中，实验室使用的Taq DNA 聚合酶在平端双链DNA 的3’末端加一个碱基A，获得的目的基因末端A必须和载体末端T 配对进行克隆，虽然有较高的克隆效率，但由于Taq DNA 聚合酶缺少保真性及末端T载体不容易制备，常常导致基因克隆突变率较高，使得这一TA克隆方法的应用受到限制。大部分实验室目前使用Pfu、Phusion等PCR产物为平端的高保真聚合酶，这就要求克隆载体必须也是平端线性化制备。而平端连接所要求的实验条件较为苛刻，影响连接反应的因素很多，具体影响因素包括温度、离子浓度、DNA末端的性质和浓度、DNA片段的大小等，往往会导致连接效率无法达到要求的情况发生。例如常用的T4 DNA连接酶的平末端连接效率相比粘性末端连接效率就低的多，主要是在平连过程中线性化载体的自连效率远大于片段连接到载体中的效率，转化后涂布培养后的培养皿上蓝斑多白斑少且存在假阳性克隆，导致后续的菌落挑选培养鉴定的工作量大、挑取白斑困难、易出现双克隆、阳性克隆率低。

中国专利CN102517316A公开了促进载体和插入片段连接的方法，其基本内容是将插入片段酶切后再使用磷酸化酶处理，而载体直接使用相同的酶酶切，再将限制酶酶切和磷酸化酶处理后的插入片段与相同酶切过的载体通过DNA连接酶连接。这个方法对于插入片段处理耗时较久、酶连后有空载出现且不适合平端PCR产物与平端线性化克隆载体的连接及其后续的菌液PCR鉴定。。

发明内容

针对现有技术的不足及科学研发过程中的实际需求，本发明提供一种DNA分子片段与载体的高效连接方法，该方法能够解决平端连接过程中的平端克隆连接效率低，转化涂布培养后的培养皿上蓝斑多白斑少且存在假阳性克隆，后续的菌落挑选培养鉴定的工作量大、挑取白斑困难、易出现双克隆、不适合大样本测序分析等问题。

为了达到上述目的，本发明提供一种DNA分子片段与载体的高效连接方法，包括如下步骤：（1）酶切连接反应：将载体与DNA分子片段混合，加入缓冲液、限制性核酸内切酶和DNA连接酶，进行酶切、连接反应；（2）酶切去磷酸化反应：待反应结束后，在体系中加入限制性核酸内切酶和碱性磷酸酶，并补加缓冲液，进行酶切和去磷酸化反应。

优选地，所述限制性核酸内切酶为EcoRV或SmaI；所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶；所述载体为具有蓝白斑显色基因以及EcoRV酶切位点或SmaI酶切位点的环状克隆载体，进一步优选为pUC57、pUC19中的任意一种。

优选地，所述碱性磷酸酶为虾碱性磷酸酶、热敏碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶中的任意一种或几种，进一步优选为热敏碱性磷酸酶。

优选地，所述步骤（1）的缓冲液为10X T4 DNA 连接酶缓冲液，步骤（2）的缓冲液为10X限制性内切酶缓冲液。

优选地，所述DNA分子片段为PCR产物或经限制性核酸内切酶酶切得到的平端基因纯化产物。进一步优选地，所述PCR产物为经纯化的PCR产物。

优选地，所述步骤（1）的反应体系为：pUC57或pUC19 100 ng，PCR产物或经限制性核酸内切酶酶切得到的平端基因纯化产物 100 ng，10X T4 DNA 连接酶缓冲液 2 μl，EcoRV 1 μl，T4 DNA连接酶 1μl，用ddH2O补足至20 μl；反应条件为：37℃、5min，15℃-25℃、10min，共3个循环；所述步骤（2）的反应体系为：步骤（1）的反应体系 20 μl，EcoRV 1 μl，碱性磷酸酶 1 μl，10X限制性内切酶缓冲液 2 μl，反应条件为：37℃ 30min。

优选地，该方法还包括步骤（3）：将步骤（2）的反应产物转化感受态细胞，菌液涂板培养，挑斑培养，对菌落进行PCR鉴定。

优选地，步骤（3）的具体操作方法为：

A、转化感受态细胞