[发明专利]鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种用LMH细胞系生产鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)传代细胞系LMH细胞的制备：将LMH细胞用胰酶-EDTA消化液进行消化分散传代，加入DMEM培养液在37℃、5％CO₂培养箱中培养，直至形成生长良好的细胞单层，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于鸡传染性法氏囊病毒和禽腺病毒4型病毒接种；

(2)种毒繁殖：分别将鸡传染性法氏囊病毒和禽腺病毒4型病毒毒种按终体积为1:50～1:500接种到步骤(1)制备的单层细胞，并在37℃吸附30～60分钟后吸弃病毒液，加入细胞维持液于37℃、5％CO₂单独培养58±2小时，直至细胞病变CPE达80％以上，分别收获鸡传染性法氏囊细胞病毒液和禽腺病毒4型细胞病毒液；

(3)病毒收集、浓缩和纯化：分别将收获的鸡传染性法氏囊细胞病毒液和禽腺病毒4型细胞病毒液置于-20℃反复冻融两次，5000rpm，4℃离心10min后收集上清液，然后分别使用50K中空纤维柱进行浓缩，即为鸡传染性法氏囊制苗病毒液和禽腺病毒4型制苗病毒液；

(4)将上述两种病毒的制苗病毒液进行灭活后，等体积混合，乳化制成乳剂型灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的用LMH细胞系生产鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的DMEM培养液中含5～10％(v/v)新生牛血清、1.0～1.2％(v/v)双抗和0.5～2.5％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸，所述的双抗为含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素溶液。

3.根据权利要求1所述的用LMH细胞系生产鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(1)中胰酶-EDTA消化液为含有0.025％(m/v)的胰酶，0.02％(m/v)EDTA的Hank’s溶液。

4.根据权利要求1所述的用LMH细胞系生产鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(2)的细胞维持液为包含有0.5～1.5％(v/v)新生牛血清、0.2～0.5％(m/v)谷氨酰胺、1.0～1.2％(v/v)双抗、1～3％(v/v)脂质体复合物和1～2％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培养液。

5.根据权利要求4所述的用LMH细胞系生产鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗的方法，其特征在于，所述的脂质体复合物为内部包含过氧化氢酶的复合物。

6.根据权利要求5所述的用LMH细胞系生产鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗的方法，其特征在于，所述的脂质体复合物的制备为：

(1)称取0.2g磷脂酰胆碱、0.08g胆固醇、0.04g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于50mL乙醇，超声处理5min；

(2)然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去乙醇，静置30min，加入100mL pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，在35℃水浴中振荡水化反应约1h，得脂质体悬浮液；

(3)使用注射器式滤器调整脂质体悬浮液的粒径至150～200nm，得到内部包含有过氧化氢酶的脂质体。

7.根据权利要求6所述的用LMH细胞系生产鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(2)中pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中含0.2～0.6％(m/v)过氧化氢酶。

8.根据权利要求4所述的用LMH细胞系生产鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(2)的细胞维持液还包含有0.05～0.2％(m/v)硫辛酸。

9.根据权利要求1所述的用LMH细胞系生产鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(4)中两种病毒的制苗病毒液等体积混合后，使0.1ml水相中鸡传染性法氏囊含量≥10^8.0TCID₅₀，禽腺病毒4型病毒含量≥10^8.2TCID₅₀。

10.根据权利要求1所述的用LMH细胞系生产鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(4)将疫苗抗原乳化制成乳剂型灭活疫苗具体为：

(1)油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司盘-80 4份，先将白油缓慢加温，加入司盘-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用；

(2)水相制备：取灭活后的鸡传染性法氏囊抗原和禽腺病毒4型各48份，加入灭菌后的吐温-80 4份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；

(3)乳化：将水相加入到油相中，利用IKA乳化剂进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即可；

(4)分装：将制备的疫苗按照每瓶250mL进行分装。