[发明专利]一种扩张蛋白和木聚糖酶融合蛋白、其编码基因和应用

说明书

本发明公开了一种扩张蛋白和木聚糖酶融合蛋白、其编码基因和应用。所述融合蛋白包括扩张蛋白EXCL和木聚糖酶XYN，EXCL位于融合蛋白的N端，XYN位于融合蛋白的C端；其中，扩张蛋白EXCL的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；木聚糖酶XYN的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。本发明还提供了在融合蛋白中插入连接肽的优选方式。本发明采用基因工程技术构建了扩张蛋白和木聚糖酶融合酶，酶活力相较于天然木聚糖酶提高了1.3倍，并对木质纤维素具有吸附能力。

技术领域

本发明属于基因工程技术及生物质利用领域，具体涉及对扩张蛋白和木聚糖酶融合蛋白基因及融合蛋白一体化生产木寡糖的应用。

背景技术

玉米在我国的分布面积极广，年产量达亿吨以上。玉米芯一般占玉米穗重量的20.0%~30.0%，且半纤维素含量高，是一种自然可再生资源。木寡糖或称低聚木糖，是由2~10个木糖分子以β-1,4糖苷键连接而成的低聚糖，木寡糖因较难被人体消化酶系统分解得以直接进入大肠，一方面被肠道内的益生菌如双歧杆菌和乳酸菌吸收代谢继而大量增殖；另一方面各微生物发酵产生的短链脂肪酸产物能降低肠道内的pH值，促进肠道功能、脂类代谢、钙和矿物质的吸收。与其它的功能性低聚糖如低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、低聚壳聚糖、低聚龙胆糖等相比，服用低聚木糖更能对有害菌进行抑制，并且使用量更少。

木寡糖常用的制备方法有化学法、酶解法、自动水解法等。与其他木寡糖制备方法相比，酶法可以有效的避免副产物以及大量单糖的产生，不需要耐高温高压的设备。目前已有多种来源的木聚糖酶利用玉米芯生产木寡糖的报道。例如，Kumar和Satyanarayana（Bioresource Technology，2015，179，382-389）报道了嗜碱芽孢杆菌TSEV1的木聚糖酶水解玉米芯可产生10.51 mg/mL木寡糖；Chapla等（Bioresource Technology，2012，115，215-221）异源表达了臭曲霉MTCC 4898的木聚糖酶，纯酶酶解玉米芯生产木寡糖，产量可达6.78mg/mL。然而，木聚糖酶通常难以作用于不溶性的木聚糖，对半纤维素的识别能力和结合能力较弱，造成产品的后期分离难度和成本的增加，严重削弱了木寡糖在工业生产中的应用前景。本发明发现，在少数真菌和细菌中存在一些在结构上类似于植物Expansin的扩张蛋白，扩张蛋白具有松散纤维素，半纤维素类材料的能力，并且对纤维素，半纤维素类底物具有吸附作用。本发明通过融合扩张蛋白来改善木聚糖酶对半纤维素的吸附和识别能力，降低了木寡糖的后期分离难度和成本。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种具有纤维素、半纤维素结合能力的扩张蛋白和木聚糖酶的融合蛋白。

本发明的上述目的采用如下技术方案实现：

一种扩张蛋白和木聚糖酶融合蛋白，所述融合蛋白包括扩张蛋白EXCL和木聚糖酶XYN，EXCL位于融合蛋白的N端，XYN位于融合蛋白的C端；其中，扩张蛋白EXCL的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；木聚糖酶XYN的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

优选的，可在扩张蛋白EXCL和木聚糖酶XYN间插入连接肽；所述连接肽为刚性连接肽(EKKKA)_n或柔性连接肽(GGGGS)_n，n=1~4；

所述连接肽还可选用天然连接肽TKDSTKDIPETPSKDKHTQENG。

本发明还提供了编码上述融合蛋白的基因。其中，所述扩张蛋白EXCL的基因EXCL来自本实验室前期筛选到枯草芽孢杆菌LC，已保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），菌种保藏号CCTCC NO：M 208073；其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；木聚糖酶XYN其基因XYN获取自Genbank，其Genbank登录号KX196201，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，可采用重叠PCR或全合成的方法来获得EXCL基因、连接肽编码基因和木聚糖酶XYN基因的融合基因。