[发明专利]一种一次性检测多种肉源性成分的检测引物、方法及试剂盒

说明书

本发明公开一种一次性检测多种肉源性成分的检测引物、方法及试剂盒。本发明设计一对全新的通用检测引物，以生鲜的肌肉组织为材料提取DNA，对提取DNA的方法进行了优化，结合二代测序技术，一次性检测出多种肉源性成分，并且还能够检出未知的肉源性成分，无需每种肉源性成分对应一套特异性引物和探针；能一次性检出多种肉源性成分；省去纯化、连接、转化等繁琐的操作步骤；准确地检出未知的肉源性成分，且重复性高。其检测结果与传统的克隆测序方法相比，更全面，更高灵敏度，具有更广的适用性，可应用于多种肉源性成分的鉴定、未知肉源性成分的溯源和微量肉源性成分的检出。

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能够一次性检测多种肉源性成分的检测引物、检测方法及检测试剂盒。

背景技术：

对于肉源性成分的鉴定，普遍使用的是实时荧光定量PCR方法。该方法有较高的灵敏度，适合加工食品微量肉源成分检测，且能相对定量，因此该方法被广泛使用。但该方法存在一定的缺点，如有些物种的特异性探针和引物难以设计，以及一套探针、引物对应某特定的单一的物种成分。为解决这一问题，也有人使用通用引物和克隆测序方法，对多种肉源性成分进行检测。但这种方法需筛选阳性克隆，工作量大、成本高、还存在漏检的情况。而关于混合样品的检出方法，如多重PCR、限制性片段多态法(RFLP)、和单链构象多态(SSCP)、随机扩增多态片段法(RAPD)都属于传统的检测方法，前三种方法不能检测样品中未知的肉源性成分，而RAPD-PCR法则存在重复性差和假阳性、假阴性等问题。

如今，二代测序技术为物种鉴定的研究提供了一种新型的方法，并已经广泛应用于环境微生物的宏基因组的研究。因其高通量的优势可对混合样品中多种的、未知的物种成分进行鉴定。但由于二代测序有读长限制，对于100bp以上的序列，测序准确率会降低，而且混合样品不能直接用标准的DNA条形码(500bp)进行物种鉴定，否则多重复片段的拼接会大大增加错误率。

发明内容：

本发明的目的是提供一种快速、灵敏、重复性高地检测多种肉源性成分的检测引物、检测方法及检测试剂盒，本发明设计一对全新的通用检测引物，以生鲜的肌肉组织为材料提取DNA，对提取DNA的方法进行了优化，结合二代测序技术，一次性检测出多种肉源性成分，并且还能够检出未知的肉源性成分，达到快速、灵敏、省时省力且准确度高的效果，从而实现了本发明的目的。

本发明的一次性检测多种肉源性成分的检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

正向引物F:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG

反向引物R:ACTATAAAGAAGATTATTACAAAGGC

本发明的一次性检测多种肉源性成分的检测试剂盒，包括PCR反应液、Ex-Taq DNA聚合酶、裂解缓冲液、TE缓冲液、苯酚、和检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

正向引物F:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG

反向引物R:ACTATAAAGAAGATTATTACAAAGGC

所述的裂解缓冲液为10mmol/L pH8.0的Tris-HCl，0.1mol/L pH8.0的EDTA和质量体积比(m/V)为0.5％的SDS。

所述的TE缓冲液为100mmol/L pH8.0的Tris-HCl和10mmol/L pH8.0的EDTA。

所述的苯酚为经0.1mol/L pH8.0的Tris-HCl平衡到pH值为8.0。

本发明的一次性检测多种肉源性成分的检测方法，用于检测肉类食品或者其他的混和的动物样品的物种鉴定，其特征在于，包括以下步骤：