[发明专利]针对PCV2高感染性的PK15细胞系及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了针对PCV2高感染性的PK15细胞系及其制备方法和应用。本发明通过对PK15细胞进行克隆，提供了一种获得高感染性、高均一性的单克隆细胞系的方法：1.培养感染PCV2的不均一的PK15细胞系；2.通过有限稀释法把PK15细胞充分稀释，加入到96孔细胞培养板中，使每孔含有0.5个细胞；3.然后扩大培养；4.通过IFA检测每个单克隆细胞株对PCV2的易感性；5.对单克隆细胞进行稳定性培养。获得了一株PK15‑2G9细胞株感染PCV2的强度远远高于PK15亲代细胞，从而为以后PCV2疫苗及诊断研究奠定了基础。

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及针对PCV2高感染性的PK15细胞系及其制备方法和应 用。

背景技术

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV-2)是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征 (postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原，目前，对PCVAD的诊断 标准、致病机理以及针对病毒本身和PCVAD的防制研究还不十分清楚。虽然目前国内外均 有针对PCV2的疫苗上市，但免疫效果仍不理想。PCV2疫苗主要是PCV2 Cap蛋白疫苗或亚 单位疫苗，主要是因为体外繁殖高病毒滴度的PCV2病毒粒子比较困难。所以，导致各实验 室运用PCV2病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)来代替PCV2研究PCV2感染。因此， 为了在体外更直接和高效的研究PCV2疫苗、诊断、治疗以及PCV2相关性疾病，我们需要 一个能够针对PCV2高感染性的PK15细胞系繁殖出高病毒滴度的病毒粒子。

目前，疫苗已经被成功运用到预防PCV2上。如今PCV2疫苗的开发、疾病诊断、治疗、以及PCV2和其他相关疾病的混合感染都需要高效的、可靠的手段来生产大量的PCV2病毒。现在，体外繁殖PCV2病毒主要是用猪肾细胞系PK15细胞。然而，PCV2病毒滴度，即50 ％组织细胞感染剂量(TCID₅₀)，得到每毫升PK15细胞培养通常从10⁴到10⁵不等。一般情 况下，PK15细胞感染PCV2的TCID₅₀不会超过10⁵，主要是由于PK15细胞系的不均一性。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了针对PCV2高感染性的PK15细胞系及其制备 方法和应用。

本发明的技术方案是：制备高感染性高均一性PK15单克隆细胞系的方法，包括以下步 骤：1.培养感染PCV2的不均一的PK15细胞系；2.通过有限稀释法把PK15细胞充分稀释， 加入到96孔细胞培养板中，使每孔含有0.5个细胞；3.然后扩大培养；4.通过IFA检测每个单克隆细胞株对PCV2的易感性；5.对单克隆细胞进行稳定性培养。

本发明的进一步改进包括：

所述步骤1中的PK15细胞系在培养之前确定其不含PCV1病毒。

本发明的另一目的在于提供一种针对PCV2高感染性的PK15细胞系，即猪肾细胞PK15 克隆株2G9，保藏编号：CCTCC NO:C2016190，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2016-11-15。

所述的针对PCV2高感染性的PK15细胞系，其TCID50为108.19TCID50/mL。

本发明进一步提供了猪肾细胞PK15克隆株2G9在制备防治仔猪断奶后多系统衰竭综合 征药物中的应用。

所述的应用，以PK15细胞系快速繁殖出高病毒滴度的病毒粒子。