[发明专利]细胞和其它复杂生物材料的色谱分离

说明书

本发明涉及靶细胞或另一复杂生物材料的色谱分离，特别是通过柱色谱法如亲和色谱法或凝胶渗透色谱法。本发明采用结合到位于靶细胞表面上的受体分子的受体结合试剂。通常，本发明为生物材料的无痕分离提供新方法，所述生物材料如细胞、细胞器、病毒等。本发明还涉及一种用于分离细胞和其他复杂生物材料的设备。

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2012年2月23日向美国专利商标局提交的美国临时专利申请61/602,150“细胞和其他复杂生物材料的色谱分离”的优先权权益，所述申请的全部内容并入本文用于全部目的。

发明领域

本发明涉及靶细胞或不同(复杂的)生物材料的色谱分离，特别是通过柱色谱法如亲和色谱法或凝胶渗透色谱法。本发明采用结合到位于靶细胞表面上的受体分子的受体结合试剂。本文公开的方法也可以被描述为(无痕)细胞亲和色谱技术(CATCH)。总之，本发明为生物材料的无痕分离提供了新方法，所述生物材料如细胞、细胞器、病毒等。本发明还涉及一种用于分离细胞和其他复杂生物材料的设备(apparatus)。

发明背景

所需细胞类型的纯的和功能性细胞群的分离是各种治疗、诊断和生物技术应用的前提。

Bonnafous等人,J.Immunol.Methods.1983Mar 11；58(1-2):93-107描述了具有通过可切割的汞-硫键固定的配体细胞亲和色谱，这意味着经由共价键固定配体。在这种方法中，Bonnafous等人将有机汞mersalyl缀合到携带伯胺基团的trisacryl珠子。根据Bonnafous等人，硫醇化配体可以通过可切割Hg-S键共价固定在这个基质上。Bonnafous等人报道了细胞分离的两个模型研究：(i)伴刀豆球蛋白A用N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯硫醇化且固定到mersalyl-trisacryl；结合到伴刀豆球蛋白A-mersalyl-trisacryl的小鼠胸腺细胞通过短硫醇处理从支持物上洗脱，其保存细胞生存力；(ii)抗-二硝基苯基抗体用S-乙酰基-巯基琥珀酸酐修饰，且固定到mersalyl-trisacryl上；之前用三硝基苯磺酸标记的绵羊红细胞结合到这种支持物且通过硫醇处理回收而没有溶血。

关于这点请注意，色谱法是一种用于分离低分子量和高分子量分子包括蛋白质的得到确认的技术。这种技术也被应用于细胞分离，特别是以亲和色谱法的形式使用特异于所需细胞类型如免疫配体的固定化配体。例如，不同的T细胞亚群如下分离：用单克隆免疫球蛋白标记和负载到具有聚丙烯酰胺珠子的柱子上，兔抗-小鼠lgG共价结合到珠子上(Braun,R.,等人,Journal of Immunological Methods(1982)54,251-258)。进一步例如，使用共价缀合到双花扁豆凝集素的Sepharose 6MB的凝集素-亲和柱层析法已被用于从健康白细胞中分离白血病细胞(Ohba,H.,等人,Cancer Letters(2002)184,207-214)。

由于细胞尺寸通常大于蛋白质，与蛋白质相比，它们很难进入常规色谱吸附剂的珠孔。由于扩散限制，使用大孔的吸着剂不能明显克服这种分离现象。另一方面，只有蛋白质可进入的孔内的表面积通常很大程度上超过蛋白质和细胞都可进入的表面积。因此，使用用于固定蛋白质性或其他受体结合配体的常规色谱吸附剂来产生用于细胞的亲和基质通常需要使用大量过剩浪费的受体结合配体，由于它们中的大部分都被固定在细胞不能进入的孔或腔中。特异受体结合试剂通常是昂贵的且很难在所需规模产生，由此需要认真考虑这方面。冷冻凝胶剂形式的整体吸附剂的使用因此被认为是一种细胞亲和色谱法的替代技术(参见例如Dainiak,M.B.,等人,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.(2007),106,101-127)。然而，整体吸附剂缺乏，以致所需的吸附剂可能无法在市场上以整体柱形式获得。此外，在亲和色谱法的情况下，通常仍需要移除用于从这些细胞中洗脱所需细胞的竞争化合物。整体吸附剂在细胞生存力方面的潜在优势可能因此被移除用于从亲和色谱柱中洗脱细胞的化合物所需的另外的程序逆转。