[发明专利]一种贝酵母转FZF1基因耐硫转化子的制备及鉴定方法

说明书

一种贝酵母转FZF1基因耐硫转化子的制备及鉴定方法，属于培育酵母菌株及鉴定方法。本发明包括：构建FZF1基因表达载体；贝酵母转基因；PCR筛选转化子；贝酵母菌株耐硫性测定；RT‑PCR检测；转化子生长曲线测定；转录组分析等。试验表明转化子A9‑FZF1‑1和A9‑FZF1‑2能在含40 mM亚硫酸钠的培养基中生长，同时本发明提供了鉴定增强FZF1基因表达的贝酵母新菌株硫代谢网络的相关基因表达量的方法。

技术领域

本发明属于培育酵母菌株及鉴定方法。

背景技术

在酿酒工艺中亚硫酸盐的耐受能力是筛选酿酒菌株的重要指标之一，贝酵母和酿酒酵母是葡萄酒生产的姊妹菌种，但贝酵母在耐硫水平上相对较弱，即使近年研究中发现了个别对硫有一定耐受能力的菌株，耐硫水平仍远低于商业用酿酒酵母的耐硫能力。

研究表明，在酿酒酵母中与耐硫相关的基因FZF1调节作为“硫泵”SSU1蛋白，将毒害细胞的亚硫酸盐泵出细胞外，可在酿酒过程中保证细胞正常生命活动，同时形成酒品的特殊风味，提高葡萄酒的品质。研究贝酵母的FZF1基因，对于研究贝酵母的耐硫机制及培育新型耐硫贝酵母均有重要意义。贝酵母与耐硫相关基因FZF1的研究的相关文献有本发明人此前发明专利“贝酵母耐硫杂交育种后代的鉴定方法”（申请号：CN201310738413.5）。该方法中我们利用了耐硫亲本与FZF1基因含有一个插入片段而与其它不耐硫的亲本在该片段存在长度差异标记杂交后代，结合含硫培养基进行筛选，获得了6个不同的耐硫贝酵母杂交后代菌株。同时，以DNA序列及ISSR图谱为鉴定依据加上耐硫表型筛选。该方法是首次用杂交的方式培育贝酵母耐硫菌株的报道，但所获得的菌株耐硫水平较低，鉴定方法差异较大，也未涉及转基因转化子的鉴定。

发明内容

本发明旨在培育耐硫水平更高的贝酵母转FZF1基因的新菌株，并提供可供选择的筛选鉴定转FZF1基因的耐硫贝酵母转化子的方法。

本发明以上目的通过以下方法实现：

一、制备贝酵母转FZF1基因耐硫转化子的方法

该方法包括贝酵母FZF1基因重组DNA载体构建和复制，以及克隆的贝酵母耐硫转化子的培养，其中：

（1）以耐硫贝酵母A9的FZF1-1基因和ACY338的FZF1-2基因作为外源基因，用BamHI和Sal I酶切，合成并构建入pGEM–T Easy载体中，构建贝酵母FZF1基因重组DNA载体；

（2）以重组DNA载体为模板，用Bam H I和Sal I对PCR产物进行酶切，引物分别为：

FZF1-1-L：5′-GCA GGA TCC ATG GCC AAT ACA AAG AAA CCT-3′，

FZF1-1-R ：5′-CAG GTC GAC TTA GTA TTC AAA TAA GCT CCT-3′；

FZF1-2-L：5′-GCA GGA TCC ATG GCA AAT AAA AAG AAA CTG-3′，

FZF1-2-R：5′-CAG GTC GAC TTA GTA TTC GAA TAA GCT CCT-3′；