[发明专利]一种用磁珠法分离游离DNA的方法及分离试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种用磁珠从血清、血浆等无细胞体液中分离游离DNA的方法及分离试剂盒。

背景技术

游离核酸最早是20世纪40年代两位法国科学家Mandel和Metais最早发现的。他们的研究发表在1947年DE BIOLOGIE DE STRASBOURG杂志上。1997年，YMD Lo等在国际著名医学期刊《柳叶刀》(Lancet)上，报道了在怀有男胎孕妇的外周血中检测到了Y染色体存在，从而证明了孕妇外周血中存在胎儿的游离DNA。随后，相关研究又发现胎儿游离DNA在孕妇外周血中的检出时间，主要与胎龄有关，胎龄越早胎儿成分相对越少。这一发现对孕妇进行无创产前检测具有重要的诊断意义。这对无创诊断提供了一种有效的途径。但血浆中母体来源的DNA占总DNA的比例非常高，一定程度上提高了检测胎儿DNA的难度。目前，游离DNA在临床上主要用于对父源性DNA检测，如SRY基因型鉴定胎儿性别、检测RhD血型及其它父源性遗传性疾病检测。产前诊断最常见的是21三体等非整倍体疾病检测，它要求对染色体拷贝数量进行精确定量，这对于游离DNA来说是个挑战。

目前，提取核酸的商品化的方法主要有硅膜离心柱吸附法和磁珠吸附法。硅膜离心柱吸附方法原理是通过核酸吸附到二氧化硅表面，其它物质如化学物、糖类、蛋白等杂质用洗涤液快速洗去，然后用洗脱液洗脱核酸，该方法简单快速，能有效的去除样本中的各种杂质，获得较纯度较高的DNA，但成本较高，需要多步高速离心，更换离心管，没有高通量的仪器配套，不适合临床大规模样本检测。磁珠法提取核酸是近几年才发展起来的核酸提取方法。其主要原理是在磁珠(主要为铁氧体)表面通过共聚合和表面修饰等引入活性基团，这些活性基团有羟基，羧基，氨基、巯基等，制备成具有磁性的亲和吸附剂，然后与核酸共同孵育后，通过疏水作用、静电作用、离子吸附等原理，使核酸吸附到磁珠表面，经过简单的洗涤，磁分离，得到表面结合有核酸的磁珠复合物，改变试剂pH值等条件可以把核酸从磁珠上洗脱下来。该方法操作简便、快速，获得的核酸纯度高，产量大，目前已有多家公司开发出配套的自动化系统，可以有效地提高工作效率。

目前，商品化的磁珠法游离核酸提取试剂盒操作复杂，需要使用蛋白酶K在37-56℃孵育样本10-30分钟，然后冷却至室温后加入无水乙醇或异丙醇，加入磁珠悬浮液进行混匀，静置5-10分钟，经过一系列漂洗步骤后置于室温晾干10-15分钟。步骤的繁琐性导致其自动化操作程度低，仪器普适性差。因此迫切需要开发操作简便、稳定高效的磁珠法游离核酸提取试剂盒。

发明内容

本发明申请内容涉及生物医学领域，拟申请一种从血清、血浆等无细胞体液中分离游离DNA的方法及提取试剂。

本发明的提取方法步骤包括：1)释放游离核酸并在特定条件下吸附于磁珠表面；2)洗涤去除化学物质和蛋白质等杂质；3)洗脱得到DNA。

本发明提供的游离DNA提取方法，其特征在于：

1)释放核酸所用裂解结合液中含有高浓度的胍盐，可以是盐酸胍、异硫氰酸胍中的一种或两种,胍盐的浓度是1-6M。

2)释放核酸所用裂解结合液中含有1-20％的表面活性剂，该表面活性剂可以是Triton X-100、Tween 20、SDS、SLS、NP-40中的一种或几种；

3)释放核酸所用裂解结合液中含有高浓度的醇类，可以是乙醇、异丙醇、聚乙二醇的一种或多种,醇的浓度是10％-100％；

4)吸附介质是表面修饰的磁珠，修饰基团是羟基，羧基，氨基中的一种或两种；

5)洗涤液中含有高浓度的醇类，可以是乙醇、异丙醇中的一种或两种；醇的浓度是50％-100％

6)洗涤液中含有高浓度的盐，可以是盐酸胍、异硫氰酸胍、氯化锂、柠檬酸钠中的一种或多种；浓度是0.5-5M

7)洗脱时所用洗脱液可以是水，还可以是含有低浓度盐离子的水。盐的浓度是1mM-100mM

本发明提供的提取试剂盒，包括以下几种组份：裂解结合液、洗涤液、洗脱液I、洗涤液II、磁珠、使用说明书。

本发明提供的提取试剂盒，其特征在于：

1)释放核酸所用裂解结合液中含有高浓度的胍盐，可以是盐酸胍、异硫氰酸胍中的一种或两种,胍盐的浓度是1-6M。

2)释放核酸所用裂解结合液中含有1-20％的表面活性剂，该表面活性剂可以是Triton X-100、Tween 20、SDS、SLS、NP-40中的一种或几种；