[发明专利]一种非蛋白氨基酸毒素的在线痕量分析方法

说明书

本发明公开了一种非蛋白氨基酸毒素的在线痕量分析的方法。所述非蛋白氨基酸毒素在线与荧光标记试剂发生荧光衍生反应，荧光标记产物经由第一维液相色谱的多通阀切换进入第一维色谱的分离柱实现第一次富集、分离；然后将所得到的分离组分经由第二维多通阀中心切割进入第二维液相色谱分离柱，完成荧光标记物的第二次富集、分离和荧光高灵敏检测，从而实现非蛋白氨基酸毒素的在线衍生痕量荧光分析；所述的非蛋白氨基酸毒素为软骨藻酸。本发明综合应用了在线标记、二维色谱富集分离和荧光分析，流程连续、背景干扰小、灵敏度高，可用于超痕量软骨藻酸等非蛋白氨基酸毒素的准确分析。

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种非蛋白氨基酸毒素的在线痕量分析方法。

背景技术

软骨藻酸（DA），属高毒性非蛋白氨基酸类贝类毒素，对生态安全以及人类健康大，其在环境中的分布和含量必须受到严格监控。软骨藻酸贝类毒素含量低、成分复杂，主要的分析技术有小鼠分析法、生物分析法、高效液相色谱法等。由于软骨藻酸缺乏生色团、无荧光特性，开展高灵敏的荧光分析时需要衍生标记，常规荧光标记试剂ADAM极不稳定（-80℃保存），难于实现室温下在线荧光衍生标记；而直接紫外检测灵敏度低，且特别受海洋背景干扰大，难于满足超痕量分析监测的要求，必须借助固相萃取柱（SPE）离线富集以提高检测灵敏度，流程繁琐、耗时长，不利于复杂环境中软骨藻酸的高灵敏分析。

目前，柱上富集技术日趋重要，在液相色谱中得到了良好的发展。常规HPLC柱上富集主要基于溶质在固定相中自发吸附, 在柱头进样过程中产生局部堆积的填料自富集浓缩作用。通过固相微萃取技术与液相色谱的在线联用，使得分析样品用量从立升级减少到毫升级甚至微升级，实现了大体积进样富集；采用阀切换技术，使样品定量恒流富集，虽然大幅度提升了灵敏度，但是背景物质同样得到了富集，导致背景谱线变得十分复杂，对痕量分析的准确带来了严重的不利影响。二维色谱分析技术对复杂组分进行预分离的基础上可以选择性进行二次分离，分离度和分辨率高，发展迅猛，对于复杂样品分析十分有利，但是该技术在二维切换过程中存在色谱流动相稀释样品区带、样品区带浓度扩散严重、分析灵敏度下降等不足。

因此，将在线荧光衍生技术、二维液相色谱分离和在线连续富集等技术协同运用，实现痕量毒素样品在柱荧光标记、背景高效分离及连续富集浓缩，对切实解决二维色谱流程中普遍存在的流动相稀释样品浓度、样品区带扩散、分析灵敏度下降等技术瓶颈十分有利，对实现复杂海洋样品中软骨藻酸的在线痕量分析具有良好应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非蛋白氨基酸毒素的在线痕量分析的方法；所述的非蛋白氨基酸毒素为软骨藻酸。本发明综合应用了在线荧光标记、二维色谱富集分离和荧光分析，流程连续、背景干扰小、灵敏度高，可用于痕量软骨藻酸等非蛋白氨基酸毒素的准确分析。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

所述一种非蛋白氨基酸毒素的在线痕量分析方法，非蛋白氨基酸毒素在线与荧光标记试剂发生荧光衍生反应，荧光标记产物经由第一维液相色谱多通阀切换进入第一维色谱分离柱实现第一次大体积进样富集、分离；然后将所得到的分离组分经由第二维多通阀中心切割进入第二维色谱分离柱，完成荧光标记产物的第二次大体积进样富集、分离和荧光高灵敏分析，从而实现非蛋白氨基酸毒素的在线痕量分析；所述非蛋白氨基酸毒素为软骨藻酸。

所述一种非蛋白氨基酸毒素的在线痕量分析方法，应用一种在线衍生-二维液相色谱连续富集分离装置而实现，所述的在线衍生二维液相色谱连续富集分离装置是由在线荧光衍生模块和二维液相色谱连续富集分离模块组成；