[发明专利]一种与肺腺癌早期诊断相关的血清外泌体中的miRNA标志物及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和诊断学领域，具体涉及一种用于肺腺癌早期诊断的血清外泌体miRNA标志物及应用。

背景技术

肺癌诊断缺乏早期诊断方法和特异性生物标志物

肺癌是全球范围内第二大高发癌症(男性发病率最高为前列腺癌；女性发病率最高为乳腺癌)。全球每年死于肺癌的人数超过120万人次，约占全球死亡人数的28％。虽然目前一些应用于肺癌诊治的分子靶向疗法颇有成效，然而病人的五年生存率仍不容乐观。原因在于缺乏早期的诊断方法和诊断分子标志物，大部分肺癌患者确诊时已处于疾病晚期。

目前肺癌的诊断主要依赖于胸部X线检查、胸部CT、磁共振显像(MRI)等影像学诊断、病理组织学诊断和血清学肿瘤标志物的化学诊断。临床上应用于肺癌诊断的血清分子标志物为癌胚抗原(CEA)，神经元特异性烯醇化酶(NSE)，鳞状细胞癌抗原(SCC)，糖链抗原125(CA125)，角蛋白19片段(CYFRA21-1)，组织多肽抗原(TPA)等。而这些血清学标志物为广谱的癌症诊断分子标志物，对于肺癌的特异性诊断和早期诊断所发挥的作用具有很大的局限性。因此，开发肺癌特异性的血清学分子标志物对于肺癌的早期诊断无疑具有重要的临床意义。

外泌体是体液活检的重要组成部分；能反映其所来源组织的动态信息

体液活检目前常用检测的对象有循环肿瘤细胞、cell-free DNA、循环RNA和外泌体等。外泌体是细胞经过"内吞-融合-外排"而形成的细胞外纳米级小囊泡，直径为30-100nm。正常细胞和癌细胞在生理和病理条件下均能够释放外泌体。外泌体不仅存在于细胞培养基中，在体液中也广泛存在。常用的外泌体提取方法为蔗糖密度梯度离心(1.13–1.19g/mL)或超速离心法(100，000g for 70min)。外泌体为脂质双层膜结构，其膜表面高表达四跨膜蛋白超家族如CD63，CD81，CD9，热休克蛋白(HSP)和MHCI，而这些蛋白也成为外泌体鉴定的表面标记物。外泌体在血液、尿液、腹水甚至羊水等体液中广泛存在，并且可以通过体液运输。外泌体的内容物包含很多遗传信息(蛋白、mRNA和miRNA)，这些遗传物质能够反映其所在周围环境和其所来源组织的动态信息。

开发肺癌外周血液样本中microRNA作为生物标志物的必要性

所谓疾病的生物标志物，是指在疾病发生发展过程中，由于机体的内环境稳态改变、生理代谢过程异常等而引起的异常化的生物指标。通过检测某种疾病特定的生物标志物，对于疾病的诊断、治疗和疗效评价、预防乃至预后评估都具有重要的指导性作用。外周血液样本在众多的体液样本中是临床检验上必不可少的常规检测项目，因此开发外周血液样本来源的生物标志物，必然具有重要的临床疾病辅助诊断作用。

由于临床上目前辅助肺癌诊断的血清分子标志物为肿瘤学常用的广谱标志物，因此临床研究者们正致力于开发肺癌血清中的肺癌生物标志物以提高诊治的准确性。miRNA作为一种21-23nt的小分子RNA，在肿瘤的发展、转移过程中发挥重要的调节作用。差异表达的miRNA可能作为疾病早期诊断、分子分型和预后诊断的指标。

体液来源外泌体miRNA与体液中游离miRNA相比在临床诊断应用方面的优势

(1)外泌体中分子内容物含量丰富：目前在外泌体中共发现9769种蛋白质、3408种mRNAs、2838种micro RNAs和1116种脂质分子。因此，筛选肺癌外周血液样本来源的外泌体中的差异表达的miRNA，可能作为诊断、预测和治疗的生物标志物。

(2)稳定性强：外泌体直径仅30～100nm，可以避免被巨噬细胞吞噬。另外，外泌体的脂质双层膜结构所包含的生物分子，使其不被体液中的酶类降解。因此，与cell-free DNA、循环RNA等游离生物分子相比，检测外泌体内容物中与疾病相关的生物标志物，可以得到更为稳定的数据。

(3)特异性强：外泌体miRNA不是随机整合入外泌体中的，而是通过一种选择机制进入外泌体，因此外泌体中的miRNA更具特异性。

(4)检测流程易标准化：外泌体miRNA因其稳定性好、含量较为丰富等特点，使其试验方法更容易标准化，所以，研究外泌体miRNA相比于直接分析血液中游离miRNA具有明显的优势。

因此，外泌体可以作为临床体液样本的重要检测项目，其存在的广泛性、良好的生物稳定性、样本来源的简易而又非侵入性使其在临床样本检验、诊断方面具有不容忽视的应用前景。开发血清外泌体中与肺癌早期诊断相关的血清外泌体中miRNA标志物，必然提高肺癌诊断的准确率和特异性，从而有利于肺癌的早期诊断。