[发明专利]一种病原性鱼肠道弧菌快速检测试纸

说明书

本发明提供一种病原性鱼肠道弧菌的竞争免疫层析快速检测试纸，能特异性的对鱼类病原性鱼肠道弧菌进行快速检测，并能避免交叉免疫反应导致的检测误差。本发明提供的鱼肠道弧菌快检测试纸其硝酸纤维素膜上从靠近金标垫一侧开始设有依次排列的四条检测线T1、T2、T3、T4和一条质控线，其中检测线T1为鱼肠道弧菌的外膜蛋白、检测线T2为鞭毛蛋白、检测线T3为鱼肠道弧菌的胞外产物、检测线T4为全菌破碎蛋白；质控线C包被有羊抗兔IgG。本发明将病原菌的多种抗原特异性的排列组合在一起与待检样品同时进行反应，且在T4线上特别设置全菌蛋白，解决了其他菌的共同抗原导致的交叉反应对结果判定的干扰问题，可以准确区别阳性结果与交叉反应。

技术领域

本发明属于病原微生物检测技术领域，具体涉及一种病原性鱼肠道弧菌(Vibrioichthyoenteri)快速检测试纸及其制备方法。

背景技术

鱼肠道弧菌是革兰氏阴性菌，是海洋环境中常见菌群之一，广泛分布在海水和生物群体中，它的致病性受宿主的生理状况和水质环境条件等综合因素影响，是一种条件致病菌。鱼肠道弧菌能够引起多种养殖鱼类发病，给水产养殖业造成严重的经济损失。有效快速的检测诊断是预防和控制该病原菌传播的关键。

目前常用的鱼肠道弧菌的检测方法有间接免疫荧光抗体技术、免疫酶联反应、聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR等，但这些技术在实用性上皆有一定的局限，耗时长，操作复杂，需要专业设备和人员，不适用于普通养殖人员在现场对鱼肠道弧菌的实时检测。胶体金免疫层析试纸具有易于携带、操作简便快捷、结果肉眼可见、不需要专业人员和设备、经济实用等优点，是一种十分有发展前景的现场快速检测技术。水产动物中虽已制备多种养殖动物病原的单(多)克隆抗体，但现场快速检测试纸技术未能得到很好地开发，目前尚无鱼肠道弧菌胶体金快速检测试纸的报道。

细菌是多种抗原成分组成的复合体，其抗原包括菌体抗原、鞭毛抗原、荚膜抗原和菌毛抗原等，可诱导机体产生抗体，因此，可利用抗原-抗体特异性反应原理以达到确诊病原的目的。但是，因分类地位相近，不同弧菌间往往具有共同的抗原性蛋白，导致不同细菌/弧菌之间存在交叉免疫反应性，从而对检测结果的准确判定造成干扰，因此，准确判定是某种病原菌感染还是其他菌的交叉反应是免疫学技术检测病原时需要解决的关键问题。通常的解决方案是通过筛选病原菌特有的抗原/抗体以提高检测准确性，但是，水产动物病原性弧菌种类繁多，多种病原菌可能与鱼肠道弧菌具有共同抗原，共同抗原的存在增加了筛选难度，工作量繁重。

发明内容

本发明的目的是提供一种病原性鱼肠道弧菌的快速检测试纸，能特异性的对鱼类病原性鱼肠道弧菌进行快速检测，并能避免交叉免疫反应导致的检测误差。

本发明提供的鱼肠道弧菌快检测试纸，包括载体板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中样品垫和吸水垫位于载体板的两端，硝酸纤维素膜位于载体板的中部；样品垫与硝酸纤维素膜交界处设有载有金标兔抗鱼肠道弧菌抗体的金标垫，金标垫一端边缘重叠在样品垫之下，另一端边缘重叠在硝酸纤维素膜之上；硝酸纤维素膜上从靠近金标垫一侧开始设有依次排列的四条检测线T1、T2、T3、T4和一条质控线，其中检测线T1为鱼肠道弧菌的外膜蛋白、检测线T2为鞭毛蛋白、检测线T3为鱼肠道弧菌的胞外产物、检测线T4为全菌破碎蛋白；质控线C包被有羊抗兔IgG。

上述使用的兔抗鱼肠道弧菌抗体，其制备方法如下：

将鱼肠道弧菌扩大培养，并将菌液浓度调至1×10⁸CFU/mL，福尔马林灭活后免疫纯种新西兰大白兔；第一次混入弗氏完全佐剂，；间隔一周后加强免疫，混入弗氏不完全佐剂，间隔两周后重复一次；一周后取血，分离得到血清，纯化得到兔抗鱼肠道弧菌抗体。

所述的鱼肠道弧菌外膜蛋白，其制备方法如下：