[发明专利]柏树微卫星分子标记组合、引物筛选方法及其应用

说明书

本发明公开了一组多态性柏树叶绿体微卫星分子标记组合，其引物组合及筛选方法、和应用，属林业分子生物学技术领域。应用中，鉴定柏树叶绿体微卫星分子标记引物多态性的方法包括：对设计的引物对正向引物的5’端加上M13尾巴序列与特异反向引物及带有荧光标记的通用型M13引物和基因组DNA混合并进行PCR扩增、电泳分离测序得到柏树叶绿体微卫星分子标记的多态性引物；鉴定柏树亲缘关系的方法包括：提取柏树的基因组DNA；采用柏树叶绿体微卫星分子标记的多态性引物进行PCR扩增、电泳分离，毛细管电泳测序，统计STR多态性，多态性引物能够反映柏树细胞质基因组的遗传信息，可用于柏树的种质资源分类、遗传多样性分析等研究。

技术领域

本发明涉及林业分子生物技术领域，具体涉及柏树分子标记技术，更具体涉及一种柏树微卫星分子标记及其筛选方法和在鉴定柏树亲源关系及品种鉴定和辅助育种中等领域的应用。

背景技术

柏科植物很多种类是主要的木材原料，并且被广泛地应用于园艺、医药等领域。柏树全身是宝，树脂、树油、果实、枝节、树叶均能入药使用。而以侧柏的种子柏子仁和侧柏叶在临床上应用得最为广泛。种仁：甘，平，可养心安神，止汗，润肠。枝梢及叶：苦涩，微寒凉血止血，生发乌发，可治吐血、痢疾、痔疮、烫伤等症。中国传统中医学认为，柏树发出的芳香气体具有清热解毒、燥湿杀虫的作用，可祛病抗邪，培养人体正气。据测试，其主要成分为菘萜、柠檬萜。这些天然物质不仅能杀灭细菌、病毒，净化空气，而且具有松弛精神、稳定情绪的作用。人们吸入柏树的香味后，可使血压下降，大脑血流量减少，抑郁情绪得到缓解。柏树的根、杆、疙头都含有挥发油，名日柏木油(Cedarwood oil)或柏香油。柏木原油经减压蒸馏而得柏木精油，出口一般叫B、P、C柏木精油，它的主要成分是柏木醇(柏木脑)、柏木烯和少量的萜烯类化合物。柏木精油广泛应用于香料、医药和国防工业的原料。

柏科种植资源丰富，是分布最广的针叶植物，除了南极洲以外世界各地都有它的分布，包括27个属(其中有17个单型属)大约有142个种。长期的自然进化和选择过程，产生了丰富的遗传变异资源，又称种植资源。种质资源的准确区分与鉴定是进行良种选育和遗传改良的基础。但是关于柏科资源分布、种群遗传多样性和种质资源保护等方面的研究尚未见报道，对于柏科植物的种质资源鉴定、分子辅助选育等方面研究尚属空白。微卫星有助于鉴定柏树品系，并区分出伪品。同时，利用微卫星标记对柏树分子育种的研究尚且很少，其中一个重要的限制因素就是分子标记技术的缺乏，尤其是柏科的基因组巨大而复杂，低成本、高通量的分子标记技术的建立对于柏科遗传鉴定、分子辅助选育有重要价值。

微卫星(Microsatellite)又称作短串连重复(Short Tandem Repeats，STRs)、简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSRs)、简单序列长度多态性(SSLP)。是指一类遍布于生物基因组中的由几个核苷酸对(称为核心序列，一般为1～6bps)为重复单位组成的简单串联重复。其重复次数在同一物种不同的遗传型间是高度可变的，但这段重复的两端却是相对保守的单拷贝序列，与其它标记技术相比，具有以下特点：首先，在每个微卫星DNA两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，尤其在亲缘关系相近的物种间是保守的，而且在一些紧密相关的物种中其重复单位和重复次数具有一定的相似性。其次，这些小的、串联排列的重复序列经常是通过核苷酸链的滑动错配或者其它未知的过程来改变它们的长度，从而导致微卫星在数量上的差异。微卫星的突变率高：每代每个配子的每个位点有25每个配子的～15每个配子突变，因此造成了它们的多态性。微卫星寡聚核苷酸的重复次数在同一物种的不同基因型间差异很大。微卫星通常是复等位的，代表每个微卫星位点的等位基因数目高度可变。微卫星DNA的多态性比RFLP显著增高据此设计引物，即可通过PCR技术分析核心序列重复次数的变异，在不同的遗传型间检测到多态。根据重复单元的构成，微卫星DNA序列被分为3种类型：单一型(pure)，复合型(compound)和间断型(interrupted)