[发明专利]用酵母制备三聚体埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法

说明书

本发明公开了一种用酵母制备三聚体埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法。该方法包括如下步骤：1)将编码埃博拉病毒糖蛋白突变体(缺失了黏蛋白样区域和C‑端穿膜区的博拉病毒糖蛋白)的基因导入受体酵母细胞中，得到重组酵母细胞；2)对重组酵母细胞依次进行培养、破碎，从破碎产物中获得博拉病毒糖蛋白突变体。用本发明制备的埃博拉病毒糖蛋白突变体所制备的埃博拉出血热预防用疫苗，可诱导小鼠产生显著的针对埃博拉病毒糖蛋白的抗体滴度。本发明具有工程菌株构建、培养周期短、培养条件简单、成本低、适于大规模发酵、安全、无毒素产生以及可进行蛋白质翻译后修饰加工扥典型特点，适合在突发疫情等应急条件下，进行疫苗高效研发和大规模生产。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用酵母菌制备具有三聚体结构的埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法。

背景技术

埃博拉病毒包膜糖蛋白(GP)是埃博拉病毒表面的唯一表面蛋白，以三聚体为一个结构单元的形式存在，埃博拉病毒的包膜糖蛋白GP是病毒粒子唯一的表面蛋白，在病毒入侵的过程中发挥着重要的作用，同时也是中和抗体主要的作用靶标，因此是埃博拉出血热预防疫苗的主要成分。

疫苗接种作为一种最简单有效的防治手段，在病毒疫情的预防中有着重要的作用，在埃博拉病毒疫苗的开发上，现有的研究内容大致分为如下几大类：第一类包括灭活疫苗、反向遗传修饰的疫苗和DNA疫苗，这一类的疫苗在目前对于此类疫苗的免疫原性、安全性和有效性进行研究中，已经被证明不适合作为埃博拉疫苗的疫苗类型；第二类我们称为载体类疫苗，此类疫苗是利用腺病毒(Adenovirus)载体、水疱性口炎病毒(Vesicularstomatitis virus,VSV)载体、牛痘病毒载体、人3型副流感病毒载体、新城疫病毒载体、狂犬病毒载体等插入埃博拉病毒部分抗原基因开发得到的疫苗形式，这类疫苗已经被证明拥有很好的保护力而且其安全性也很好，但是作为载体类疫苗其缺点在于预存免疫和疫苗的保存运输要求较高；第三类为蛋白类疫苗，蛋白类疫苗顾名思义就是以病毒蛋白组分作为主要组成部分的一类疫苗，现在研究的主要有病毒样颗粒疫苗(VLPs)和亚单位疫苗。有研究显示，在哺乳动物细胞或者杆状病毒表达系统中共表达GP蛋白和VP40蛋白，或者GP蛋白、VP40蛋白和NP蛋白时可以自组装形成病毒样的颗粒，利用VLPs免疫后攻毒可以使食蟹猴获得100％的保护，而且疫苗诱导动物产生了明显的体液和细胞免疫反应。而以GP融合人IgG1Fc段重组蛋白作为保护性抗原制备的亚单位疫苗也在被证实可以给与小鼠和豚鼠百分百的保护力。

在天然状态下GP蛋白以一个三聚体为一个结构单元镶嵌在病毒膜上，三聚体的保持对于EBOV-GP蛋白功能和免疫原性的保持有着重要的作用。GP蛋白是一个高度糖基化修饰的蛋白，在GP1上存在着聚糖帽(Glycan Cap)和黏蛋白样区(mucin like domain，MLD)两个高度糖基化修饰的区域。在病毒入侵的过程中会由组织蛋白酶B/L的切割切除GlycanCap和mucin like domain两个高度糖基化修饰的糖帽使其RBS与宿主细胞上的NCP1受体结合，激发GP2上的融合loop发生变构，介导病毒的入侵。