[发明专利]利用RT－LAMP方法快速检测玉米粗缩病病原

说明书

技术领域：

本发明涉及玉米粗缩病病原的快速检测技术及其在病害诊断和测报上的应用，属于农业科学技术领域。

背景技术：

玉米粗缩病(Maize rough dwarf disease，MRDD)在我国病原物为水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)，属于呼肠孤病毒科斐济病毒属第二组成员，以灰飞虱为主要传毒介体进行持久性传播，灰飞虱一旦染毒，终身带毒，并能连续传毒，但不经卵传毒。自然条件下，主要寄主有水稻、玉米、大麦、小麦、高粱、粟、看麦娘、稗草及狗尾巴草等禾本科植物。感染玉米粗缩病玉米植株的典型症状为植株矮缩，叶色浓绿，叶片僵直、宽短而厚，叶背面出现蜡白色短条状突起，后期变褐色，籽粒较少或不结籽粒。自1954年在新疆和甘肃省发现该病害以来，玉米粗缩病在我国各玉米产区均有不同程度发生，特别是近年来由于气候环境变化和种植结构的调整，玉米粗缩病的发生呈现明显的上升趋势，给玉米产量带来严重损失。

目前植物病毒鉴定常用的方法有：生物学接种实验、血清学检测、电镜观察及分子生物学方法。这些方法大都需要特定仪器且耗时久，不适用于田间快速检测。环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi T等在2000年发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法，是一种高灵敏链置换技术，一种新型PCR替代技术。LAMP特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶-Bst(Bacillus stearothermophilus)DNA polymerase在恒温(60-65℃)的条件下反应1小时左右即可完成核酸扩增反应。钙黄绿素是一种荧光染料，在LAMP反应之前加入到反应体系中，避免了开盖造成的反应产物污染，这与SYBR Green I染料不同。通过荧光染色直接目测比色就可以得到清晰的反应结果。不需要长时间的温度循环，不需要PCR仪等昂贵的仪器，不需要繁琐的电泳紫外观察等过程。目前已广泛应用于人类和动植物各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测和快速诊断中。

发明内容：

本发明提供了一种快速检测玉米粗缩病病原的方法，通过该方法可以快速诊断出玉米是否携带该病毒。

本发明所提供的一种快速检测玉米粗缩病病原的方法，是通过以下方法获得的：

1)根据NCBI已报道水稻黑条矮缩病毒S10核苷酸序列，通过软件DNAstar分析后选择相对保守区域700-1700bp，利用AJ297433.1上对应区域通过在线引物设计软件primerExplorer V4(http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计4条引物，其中包括2条外引物F3/B3和2条内引物FIP/BIP；

2)Trizol reagent提取植株总RNA；

3)设置不同内外引物浓度比例、Mg²⁺浓度、Mn²⁺浓度、钙黄绿素浓度，确定最佳反应体系；分别改变反应时间和温度进行RT-LAMP扩增反应，确定最佳反应条件；

4)与RT-PCR方法进行比较，验证RT-LAMP方法的可靠性；

本发明提供的引物序列如下：

F3 TTTCGGCTTTGAAAACAGT

B3 TGCCATCGTAATTAGTGCG

FIP TGCGCTCCAAGTTTGTTCGATGAAAAAGAACTAAGTGTTTTGG

RIP ATTTGTTGAAACATGGCAGGTTAAACGTGGACAAACTGGTCAAT。

RT-LAMP的反应温度为60-65℃，反应时间为90-150min。

一种检测玉米上玉米粗缩病病原方法的应用包括：玉米疑似病株的快速诊断与鉴别。

利用这一方法可以快速鉴定出玉米植株是否感染玉米粗缩病，进而采取针对性的防治策略，减少病害带来的损失。

附图说明：

图1：不同反应温度条件下RT-LAMP结果的电泳图(A，RT-LAMP反应电泳图；B，钙黄绿素颜色变化图；M，标准分子量；1，60℃；2，61℃；3，62℃；4，63℃；5，64℃；6，65℃；7，阴性对照)。