[发明专利]一种核酸第三代测序原始数据的处理方法及其应用

说明书

本申请公开了一种核酸第三代测序原始数据的处理方法及其应用。本申请的核酸第三代测序原始数据的处理方法，包括将第二代短序列数据比对到第三代自纠错数据上，统计比对结果中第三代自纠错数据的单碱基覆盖深度，将单碱基覆盖深度低于阈值的区域屏蔽为N，采用第二代测序的补洞软件对N屏蔽区域进行补洞，以获得单碱基错误率较低的核酸第三代测序数据。本申请的核酸第三代测序原始数据的处理方法，利用第二代短序列数据与第三代长序列数据进行比对，并利用第二代测序的补洞软件对比对结果中单碱基覆盖深度较低的N屏蔽区进行补齐，有效的降低了第三代测序数据中的单碱基错误率，提高了测序质量。

技术领域

本申请涉及核酸测序数据处理领域，特别是涉及一种核酸第三代测序原始数据的处理方法及其应用。

背景技术

随着第二代测序技术(Next-generation sequencing，NGS)的成熟和普及，测序成本大大降低，其中二代测序仪Hiseq2500一次运行就可产出600Gb的数据量，相当于人类基因组的200倍。二代测序技术虽然可以快速产出大量数据，但是其有一个致命的缺点就是测序读长过短，众所周知，基因组组装最重要的指标就是N50以及基因组的完整度，但是传统二代测序技术由于其读长过短，其组装算法大多都是基于德布鲁因图论(de Bruijngraph)的思想，从而使得组装中遇到的最大的挑战就是解决高重复及高杂合基因组。

把组装出的重叠群(Contig)或骨架序列(Scaffold)从大到小排列，当其累计长度刚刚超过全部组装序列总长度50％时，最后一个重叠群(Contig)或骨架序列(Scaffold)的大小即为N50的大小，N50对评价基因测序的完整性有重要意义。把组装出的重叠群(Contig)或骨架序列(Scaffold)从大到小排列，当其累计长度刚刚超过全部组装序列总长度90％时，最后一个重叠群(Contig)或骨架序列(Scaffold)的大小即为N90的大小。

在一条骨架序列(Scaffold)中，重叠群(Contig)之间无序列信息且被表示为N的区域，被称为洞(gap)。

K-mer是指将一条长度为L的序列，按照长度K由L序列的5’到3’端挨个碱基进行分割，从而得到L-K+1个长度为K的核苷酸序列。例如，长度为90bp的短序列，按照17bp从头到尾挨个碱基进行分割，可以得到74个17bp的连续序列，即17-mer序列。

第三代测序技术也称为单分子实时测序技术(Single Molecule Real Time,SMRT)。PacBio第三代测序仪具有超长读长、无PCR扩增偏差的单分子测序、直接分析碱基修饰等技术优势，已经快速应用于基因组de novo组装、转录组学研究等领域，其平均读长10-15Kb，最长读长可超过40Kb。第三代测序技术的优势就在于单分子测序，对于高杂合、高重复、或者高GC，不存在任何偏好，所以三代测序技术可以显著的提升重叠群(Contig)组装水平。

但是，第三代数据最大的问题就在于其极高的单碱基错误率，高达15％。其错误类型主要是插入缺失，并且随机分布，可以通过生物信息的手段进行一定程度的修正，目前发布的三代组装流程中，如SMRT、Falcon、Pbcr、Canu，都具有第三代数据自纠错的功能，可以将20倍以上的三代数据的错误率从15％降低到3％左右，但是3％的错误率对于基于OLC(Overlap-Layout-Consensus)算法的组装软件干扰依然很大。

因此，亟需一种错误率更低的第三代测序数据的处理方法，以提高核酸第三代测序的质量。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的核酸第三代测序原始数据的处理方法，及其应用。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：