[发明专利]一种结构光照明超分辨显微成像方法

说明书

本发明公开了一种结构光照明超分辨显微成像系统及其成像方法。本发明的成像系统包括：照明光源、旋转结构光生成器、第一会聚透镜、分光镜、物镜、载物台、样品、第二会聚透镜、数字成像设备和计算机；本发明通过成像图像重建算法处理原始图像，只需要旋转4次结构光条纹，不需要相位平移即可实现超分辨；成像图像重建算法基于频域处理而非空间域处理；样品的超分辨图像的频谱的过程，与传统频域方法不同，并非逐个结构光方向进行解析，而是将所有方向合并进行解析；为获得传统的各向均一的2倍分辨率提升，理论上原始图像数量可以从传统方法的9幅减少至4幅；进一步减少原始图像数量至3幅，理论上可获得各向均一的1.5倍左右的分辨率提升。

技术领域

本发明涉及光学显微成像技术，具体涉及一种结构光照明超分辨显微成像系统及其成像方法。

背景技术

超分辨光学显微技术利用对荧光发射在空间或时间上的调制，实现了突破光学衍射极限的显微成像。结构光照明超分辨显微成像技术(Structure IlluminationMicroscopy,SIM)，是在宽场荧光显微的基础上，利用特殊调制的结构光照明样品，运用特定算法从调制图像中提取高频信息，突破衍射极限的限制。

二维SIM的常规重建方法需要至少9张原始图像。该重建方法由Gustafsson提出^[1]，在每一个照明方向取3个不同的初相位值，获得3幅原始图像，通过解线性方程组得到频域中的高频成分；为保证在各个方向上分辨率均得到2倍提升，通常照明条纹需选取3个不同方向，也就是说总共需要9张原始图像。另外Heintzmann和Cremer提出了一种四相位重构方法，计算量小，但在每一方向的照明条纹需要获取4幅原始图像，且对照明条纹的初相位取值精度的要求较高，因而并不常用^[2]。有一些新方法可以将重建所需的图像数量降低，最低可至到4张^[3，4]，但这些方法基于空间域的迭代，而非传统方法中的频域求解，既有可能产生更多的伪像，也未能提供迭代一定收敛的理论解释。并且这些降低所需图像数量的方法，对结构光位相的精度要求更高。而从系统搭建的角度看，利用光栅来产生照明条纹时，需用机械的方式来控制光栅平移，造成速度和精度的牺牲。

发明内容

针对以上现有技术中存在的问题，本发明提出了一种结构光照明超分辨显微成像方法及配套成像系统；本发明的成像方法能有效降低需要的原始图像数量，且能只需旋转照明条纹，不需平移。

本发明的一个目的在于提出一种结构光照明超分辨显微成像系统。

本发明的结构光照明超分辨显微成像系统包括：照明光源、旋转结构光生成器、第一会聚透镜、分光镜、物镜、载物台、样品、第二会聚透镜、数字成像设备和计算机；其中，数字成像设备通过数据线连接至计算机；照明光源发出激发光；激发光经旋转结构光生成器发生衍射；衍射的激发光经第一会聚透镜会聚后，经二向色镜，由物镜聚焦，照射在放置在载物台上的样品上，形成结构光条纹；样品在结构光条纹的激发下发射荧光；荧光经物镜聚焦后，经二向色镜后，再经第二会聚透镜会聚，由数字成像设备采集荧光，并将光信号转换成电信号后传输至计算机；计算机形成原始图像；旋转样品上的结构光条纹至新的角度，在每一个角度上分别采集形成一幅原始图像，形成4幅以上或3幅的原始图像；通过成像图像重建算法处理原始图像，得到样品的超分辨图像。

旋转结构光生成器采用光栅、数字微镜阵列或空间光调制器。如果旋转结构光生成器采用光栅，则将光栅或者放置样品的载物台设置在旋转装置上，旋转装置以光轴为旋转轴，带动光栅或载物台能够360°旋转，从而带动光栅与样品之间发生相对角度变化，使得样品上的结构光条纹旋转至新的角度；如果旋转结构光生成器采用数字微镜阵列或空间光调制器，通过数字方式生成光条纹产生角度变化，使得样品上的结构光条纹旋转至新的角度。

照明光源采用激光光源、LED光源或汞灯光源。

分光镜采用二向色镜或半透半反镜。

本发明的另一个目的在于提供一种结构光照明超分辨显微成像方法。