[发明专利]一种鹿中结核分枝杆菌NASBA-ELISA快速检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明涉及一种生物检测技术领域，是一种鹿中结核分枝杆菌NASBA‑ELISA快速检测试剂盒，其特点是，由根据结核分枝杆菌16srRNA基因保守区序列设计的特异性引物、捕获探针、检测探针，优化的NASBA扩增体系和优化的NASBA产物检测体系组成。能对鹿中结核分枝杆菌进行简单快速的检测，具有高效的特异性和容易推广的优越性，也有助于牛型和人型多重结核分枝杆菌的早期诊断；其检测方法是设计并人工合成结核分枝杆菌基因保守区序列的特异性引物、捕获探针和检测探针，确定NASBA扩增反应程序和NASBA产物检测体系等步骤，能够同时监测人型和牛型的多重结核分枝杆菌，检测结果灵敏度高且重复性好。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，是一种鹿中结核分枝杆菌NASBA-ELISA快速检测试剂盒及检测方法。

背景技术

养鹿业是中国特种动物养殖的支柱产业之一，鹿茸、鹿角盘、鹿胎等作为传统中药，在中医治疗和保健中被日益广泛应用。但目前鹿群中结核病(Tuberculosis，简称TB)的防控防治依然没有得到有效控制，这不仅关系到广大养殖场的经济产值，对人结核病的防控也有重要影响。作为一种人畜共患病，鹿结核病是由结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，俗称结核杆菌引起的慢性、消耗性传染病，该病主要由牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌所引起的，是OIE规定必须强制报告的B类动物疫病。鹿临床症状为极度消瘦、弓背、体表淋巴结肿大、呼吸困难、共济失调、个别瘫痪，尤其是死亡率高。因此，除了防疫部门应加强防控,及时了解和掌握结核病在鹿群中的传播状况以防止疫病扩散外，必须加强对该病的监测，从而有效控制其发生与流行，从本质上将其根除。

传统检测方法：如血清学方法、病原体分离法和核酸检测方法等各有其局限性，使得对传染病的早期监控和跟踪水平停滞不前。病原菌的细菌学检查由于操作简便、快速、便于推广、无需特殊精密仪器等优点已经成为目前结核病实验室诊断的金标准。但假阳性和病原体分离繁琐费时的缺点限制了此法的诊断价值。核酸法由于检测敏感、准确、快速而日益受关注，如聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)、生物探针和基因芯片等，但都需要相应的检测设备且检测费用高未能广泛推广。因此，找到一种合适的快速诊断方法势在必行。

一种特异性等温扩增RNA的技术核酸序列依赖性扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)在病原体已经有成功应用的报道，它是由一对特异性引物介导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。反应在41℃恒温下进行,借助AMV逆转录酶、RNaseH和T7RNA聚合酶的协同作用下可在2h内将模板RNA扩增约10^9-12倍，且无需PCR仪等特殊仪器，避免了PCR仪造成的PCR扩增结果重复性差的问题，也容易在检测部门普及应用。此外，NASBA技术的高灵敏度和高特异性优势也是疫情监控的理想武器。相对环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplifcation assay，LAMP)和常规PCR技术，在结核病中的检测其灵敏度更强。这种系列试剂盒的出现和推广将使我国的动物及人兽共患重大传染病的早期监控系统更完善，并大大减少误诊率。

NASBA技术已广泛应用于HIV-1型病毒、狂犬病病毒、禽流感病毒等病原体的快速检测，也曾用于人结核分枝杆菌的检测，该方法的灵敏度仅为100CFU/mL，但基于应用对象的差异，本发明根据鹿中结核分枝杆菌设计了特异性的引物和探针，将高效的NASBA恒温扩增和简便的酶联检测方法完美结合，研发出高效的NASBA鹿结核病原体分子筛查诊断系统也称分子诊断试剂盒(简称NASBA-MP)，在短时间内对鹿结核病原体进行高灵敏度筛查，其灵敏度达到1CFU/mL，明显高于NASBA技术对人结核分枝杆菌的检测，同时，此试剂盒也适用于牛型和人型结核病原体的多重检测。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简便、快速、灵敏度高、特异性强，效果佳，应用价值高的鹿中结核分枝杆菌NASBA-ELISA快速检测试剂盒。并提供其检测方法。