[发明专利]弓形虫乳酸脱氢酶基因敲除虫株的构建方法及用途

说明书

本发明公开了一种弓形虫基因敲除虫株的构建方法，该方法敲除了弓形虫乳酸脱氢酶1和乳酸脱氢酶2两个基因，所述乳酸脱氢酶1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述乳酸脱氢酶2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述弓形虫基因敲除虫株在乳酸脱氢酶1和乳酸脱氢酶2位点分别具有如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：3所示核苷酸序列。该基因敲除虫株具有毒力小，在动物体内繁殖少等优点，能提高动物对弓形虫的免疫能力，有成为抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。

技术领域

本发明涉及一种弓形虫乳酸脱氢酶基因敲除虫株的构建方法，以及使用该方法构建的乳酸脱氢酶1(LDH1)和乳酸脱氢酶2(LDH2)双基因缺失虫株的用途。

背景技术

弓形虫是从属于顶复门原虫的专性细胞内寄生虫，在全世界范围内广泛分布，是非常重要的人畜共患病原体，能引起严重的人兽共患弓形虫病。在南美和欧洲一些地区，人群和动物的感染率高达80-90％；在中国，感染率一般在10％左右。免疫力低下的人群感染弓形虫有非常高的风险，严重时可以致死。妇女在孕期感染弓形虫将对胎儿的发育造成不良影响，引起畸形、智障、早产甚至胎儿死亡。鉴于其危害，弓形虫已被列为孕妇常规检查中的一个必检项目。在农业上，弓形虫感染重要农业动物(如羊、猪等)容易引起动物流产、肉/奶产品质量下降而产生巨大的经济损失，同时能将感染经食物传给人类。近年来，随着有机农业的兴起，动物的弓形虫感染率有上升的趋势。

因此，弓形虫病的防控对于人类健康和畜牧养殖业的发展均有重要意义。然而，到目前为止，弓形虫病的预防没有良好的疫苗，因而构建具有良好免疫原性和免疫保护力的弓形虫疫苗具有重要价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种弓形虫基因敲除虫株的构建方法，该虫株由于敲除了乳酸脱氢酶1和乳酸脱氢酶2两个基因，具有毒力小，在动物体内繁殖少等优点，能提高动物对弓形虫的免疫能力，有制备抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。

(1)本发明所述弓形虫基因敲除虫株(△LDH1△LDH2虫株)的构建：构建pSAG1-Cas9-TgU6-sgLDH2质粒、制备ldh2-5UTR::DHFR::ldh2-3UTR同源模板,共电转至出发虫株ME49，经1uM乙胺嘧啶筛选、PCR鉴定获得弓形虫基因敲除虫株△LDH2；构建pSAG1-Cas9-TgU6-sgLDH1质粒，制备ldh1-5UTR::CAT::ldh1-3UTR同源模板,电转至△LDH2,经30uM氯霉素筛选、PCR鉴定获得弓形虫基因敲除虫株△LDH1△LDH2。

(2)进行了基因敲除虫株△LDH1△LDH2毒力试验：以野生型虫株ME49为对照,腹腔接种7周龄雌性ICR小鼠，5×10²个速殖子/小鼠，每组接10只，记录30天内小鼠的存活情况。结果表明感染△LDH1△LDH2双敲除株的小鼠30天内没有死亡，存活率100％。

(3)不同剂量的△LDH1△LDH2虫株对小鼠的毒力试验：腹腔接种7周龄雌性ICR小鼠，5×10²，2×10³,8×10³和3.2×10⁴个敲除株虫子，每组接10只，对照组接5×10²个ME49速殖子/小鼠，记录30天内小鼠的存活情况。结果表明接种不同剂量的敲除株实验组小鼠30天之内没有死亡，说明弓形虫LDH1和LDH2敲除之后对小鼠的毒力下降明显。

(4)小鼠感染△LDH1△LDH2虫株后的荷虫量试验：对7周龄雌性ICR小鼠腹腔接种1×10⁵个双敲除株或野生型虫株速殖子，感染后5天，收取小鼠腹水，进行定量qPCR，分析腹水荷虫量。结果表明接种△LDH1△LDH2敲除虫株小鼠腹水荷虫量显著低于野生型ME49的对照组小鼠腹水荷虫量，说明弓形虫△LDH1△LDH2在小鼠体内无明显繁殖，可以被宿主有效清除。