[发明专利]一组核苷酸序列及在EML4‑ALK融合基因快速检测中的应用

说明书

技术领域

本发明公开了一组核苷酸序列及应用，属于基因检测技术领域。

背景技术

肺癌是世界范围内也是中国最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居恶性肿瘤的首位。肺癌是肺部肿瘤的统称，包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌。非小细胞肺癌包括鳞癌、腺癌、腺鳞癌、大细胞癌、类癌等，占肺癌的85％左右。肿瘤的发生，是一系列肿瘤相关基因突变的结果，这些基因在肿瘤的形成过程中发挥着重要作用。肿瘤研究者已经研发出多种针对肿瘤基因的靶向治疗药物，如针对EGFR基因突变肺腺癌的厄诺替尼和吉非替尼；针对肺癌中ALK融合基因突变的克唑替尼等。ALK融合基因突变中EML4-ALK融合基因是非小细胞肺癌，特别是肺腺癌的一个新的驱动基因，在肺癌中的发生率约为5％。目前，至少已有14种EML4-ALK的变异亚型被发现，这些变异亚型均为EML4的不同外显子与ALK的第20外显子相融合。亚型1(V1)，为EML4的第13外显子与ALK的第20外显子相连；亚型2(V2)，为EML4的第20外显子与ALK的第20外显子相连；亚型3(V3)，有两个亚亚型(V3a/b)，V3a为EML4的第6外显子与ALK的第20外显子相连，而V3b为EML4的第6外显子加上一个33bp的小片段再与ALK的第20外显子相连；亚型4(V4)，为EML4的第14外显子加上一个11bp的小片段再与前面缺失49bp的ALK的第20外显子相连；亚型5(V5)，有两个亚亚型(V5a/b)，V5a为EML4的第2外显子与ALK的第20外显子相连，而V3b为EML4的第2外显子加上一个117bp的小片段再与ALK的第20外显子相连；亚型6(V6)，为EML4的第13外显子加上一个49bp的小片段再与ALK的第20外显子相连；亚型7(V7)，为EML4的第14外显子与前面缺失12bp的ALK的第20外显子相连；亚型8(“V4”)，为EML4的第15外显子缺失了后面19bp再与前面缺失20bp的ALK的第20外显子相连；亚型9(“V5”)，为EML4的第18外显子与ALK的第20外显子相连。最常见的融合基因为亚型1，其次为亚型3。所有这些融合基因均具有生物学功能，其表达产物为一种嵌合型酪氨酸激酶，可激活ALK基因的膜内催化区域，激活相关信号通路，促进细胞增殖、存活、迁移，最终导致细胞癌变。目前用于ALK融合基因的检测方法主要有荧光原位杂交(FISH)、免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应等。但所有这些方法都是针对手术或者活检取材后的肿瘤组织进行的，对患者创伤性较大，难以用于常规检查，并且由于肺癌异质性的影响，所检测的肿瘤组织并不能反应肿瘤整体的情况。

外泌体由细胞内的多泡小体(Multivesicular bodies,MVB)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，直径约为40nm-100nm。外泌体广泛存在于各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、脑脊液、乳汁、腹水、羊水、眼泪、鼻腔粘液和支气管肺泡灌洗液)中，携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等，参与细胞间通讯、细胞增殖、细胞迁移、细胞分化、血管新生和免疫调节等过程。肿瘤在生长过程中会不断地将外泌体释放到周围环境中去，存在于患者的血液中，也可经血液循环到达腹水和胸膜积液等恶性病变体液中，使得通过血液等更易获得临床标本进行肿瘤相关的标志物检测成为可能。且外泌体能在4℃保存96h，或是在-80℃下保存更长时间，这些特点使得外泌体比其他样品更适用于肿瘤的早期诊断和预后判断。

为了克服现有技术检测对患者损伤较大的不足，本发明旨在提供一种能够快速检测生物样本中EML4-ALK融合基因的方法。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一组用于PCR扩增的核苷酸序列组合，所述序列组合选自由SEQ ID NO.1-8所示核苷酸序列的一种或多种。

在一个优选的实施方案中，所述序列组合由由SEQ ID NO.1-8所示核苷酸序列组成。

其次，本发明提供了所述的序列组合在EML4-ALK融合基因快速检测中的应用。

最后，本发明提供了一种快速检测EML4-ALK融合基因的方法，所述方法包括：

(1)提取生物样本的总RNA；

(2)以步骤(1)获得的RNA为模板，反转录获得cDNA；

(3)以步骤(2)获得的cDNA为板，进行PCR扩增，所述引物为由SEQ ID NO.1-8所示核苷酸序列的一种或多种；

(4)对步骤(3)获得的扩增引物进行分析。

在一个优选的实施方案中，步骤(1)所述生物样本来源于体液。

更为优选地，所述体液为血清。