[发明专利]一种维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗及规模化制备技术

说明书

技术领域

本发明属水产养殖病害免疫防治技术领域，具体涉及一种淡水鱼细菌性败血症免疫防治二联灭活疫苗及规模化制备技术。

背景技术

淡水鱼类细菌性出血病又称细菌出血性败血症是危害淡水养殖鱼类最为严重的传染病之一，危害的鱼类主要有草、鲢、鳙、鲫、鲤、鲂、鲮、鳗、鳜等鱼类，给淡水养殖业造成严重损失(达到30％以上)。该病病原主要是气单胞菌属维氏气单胞菌)和嗜水气单胞菌，他们引起的细菌性败血症病害占80％以上，为淡水鱼类最常见的致病菌。一般采用消毒剂和化药抗生素等进行防治疗，易污染水体，并引起水产品药物残留问题。疫苗能刺激动鱼体产生免疫防御病原的攻击，亦能增强机体抗不良应激的能力，作为病害防控措施之一。国内近十年来水产疫苗研制进展较快，但疫苗规模化制备方法较为缺少，基本为实验室制备技术，目前迫切需要可产业化生产的水产疫苗生产技术。

发明内容

为了解决现有技术中的诸多问题，本发明提供了一种维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗及规模化制备技术。

本发明通过如下的技术方案来实现：

一种维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗包括以下组分：维氏气单胞菌培养物灭活液和嗜水气单胞菌培养物灭活液。

优选的，所述的维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗中，维氏气单胞菌培养物灭活液占50％，其中细菌浓度不少于25×10⁸cfu/ml；嗜水气单胞菌培养物灭活液占50％，其中细菌浓度不少于25×10⁸cfu/ml。

本发明还提供了一种维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗的规模化制备技术，包括如下步骤：将维氏气单胞菌培养物灭活液，嗜水气单胞菌培养物灭活液按1:1比例混合搅拌均匀，无菌灌装，制的维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗成品。

优选的，所述维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗的规模化制备技术包括如下步骤：

1)一级种子制备：维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌菌株分别接种营养琼脂平板，28℃培养，24小时，挑菌苔接种营养肉汤培养基，28℃，摇瓶培养18-20小时，制备一级种子液各3L；

2)二级种子制备：将两个一级种子液各自接种50L种子罐，培养基为30L产毒素培养基，28℃，30L/min的通气量，搅拌通气培养12-14小时，制备二级种子液；

3)制苗菌液培养：将二级种子液各自接种500L发酵罐，培养基为300L产毒素培养基，28℃，175L/min的通气量，搅拌通气培养12-14小时，得到制备疫苗的菌液，活菌数50×10⁸cfu/ml以上为合格；

4)菌液灭活：培养物菌液分别移至500L灭活罐，两种菌液分别加入0.30％甲醛液，37℃，灭活24小时，进行无菌检验和甲醛残留检验合格，得到维氏气单胞菌培养物灭活液和嗜水气单胞菌培养物灭活液；

5)配苗分装：分别将两种细菌培养物灭活液按1：1的比例输入1000L配苗罐，罐内混合液搅拌均匀。无菌条件下进行分装、轧盖、得到维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗成品。

本发明中疫苗制备方法是通过一、二级种子液逐级放大至500L发酵罐培养，转至500灭活罐灭活，再转至1000L配苗罐混匀、配苗、分装得到疫苗成品，是一种工厂化生产技术。技术成熟、可大批量生产，每批次可生产疫苗成品700L，可供至少350万尾鱼注射免疫使用，质量稳定可控，成本低，优于小规模实验室制备技术，可产业化生产。疫苗可通过注射、浸泡等方式施用，免疫鲫鱼、草鱼等淡水养殖鱼类效果良好，注射免疫保护率达到80％以上，浸泡免疫保护率超过50％，可有效预防淡水鱼细菌性败血症，减少抗生素等化药的使用，提高水产品质量安全，减少水体污染，增加渔民收入。同时克服单一灭活苗只针对一种病原菌的缺点，提供一种二联疫苗可一次施用同时抵御两种病原菌感染，提高免疫的效果，疫苗通过浸泡、注射或拌和饲料投喂均可方便施用。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。

本实施例提供了一种维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗的规模化制备技术，包括如下步骤：

1、一级种子液制备

把保存在冰箱的菌种(维氏气单胞菌株、嗜水气单胞菌株)取出，接种营养琼脂(培养基配方见附录)，28℃培养24小时，挑菌苔接营养琼脂，28℃培养24小时，接种营养肉汤(培养基配方见附录)300ml/瓶，10瓶，放摇床200r/min，28℃，培养18小时，得到3L一级种子液。