[发明专利]一种基于高内涵技术定量分析焦油致细胞DNA损伤的方法

说明书

技术领域

本发明属于DNA损伤体外检测技术领域，更具体而言，本发明涉及焦油致细胞DNA损伤的体外定量分析方法。

背景技术

卷烟烟气可按照物质的状态分成两相，一种为气相，一种为粒相，粒相物质即为焦油。卷烟焦油中含有多种有毒物质，如超氧阴离子O·^-，过氧化氢等活性氧类物质，醛类，苯并芘等。焦油可以诱发多种癌症和呼吸道疾病，其中的活性自由基和有毒物质可以诱导DNA产生氧化性损伤、DNA链断裂、微核、基因突变等。所以，准确检测焦油对细胞DNA的损伤对于焦油的遗传毒性和危害性评价具有重要的意义。

DNA双链断裂是DNA最严重的一种损伤形式，如果这种损伤不能被正确或者及时修复就可能会导致染色体畸变或者细胞凋亡等。作为DNA双链断裂的一种生物标志物，磷酸化组蛋白γH2AX已经被广泛地应用于临床医药学、放射学及毒理学等研究方面。包括很多单体化合物和混合物通过γH2AX实验对其遗传毒性进行了测定和评价。例如，Tanaka等利用γH2AX实验对卷烟烟气冷凝物的遗传毒性进行了检测和评价；Smart等采用γH2AX实验对依托泊苷、米托蒽醌及甲基亚硝脲的DNA双链断裂的剂量-效应关系进行了研究。该实验因其灵敏性高、结合其他仪器检测技术可以进行大规模分析检测，拥有其他遗传毒性检测技术并不具备的多种优点，目前已经被广泛地应用于化合物和有毒物质的遗传毒性筛选和评价。

目前对γH2AX进行分析检测的主要方法有流式细胞仪、ELISA(酶联免疫吸附试验)、Western Blot(蛋白质印迹)、显微镜技术等。流式细胞仪和Western Blot操作繁琐，检测前需要将贴壁细胞酶解成单细胞悬液，破坏了细胞的结构和功能完整性，且检测通量较低。ELISA不能提供细胞内荧光焦点的分布情况且需要额外添加其他检测蛋白对结果进行校正，而显微镜技术的检测通量低，且人为计数的误差较大。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种无需破坏细胞、简单、有效且灵敏度高的焦油致DNA损伤的定量分析方法，该方法的检测结果准确并且可视化，以克服现有技术的缺陷。

本发明的目的通过将高内涵技术和γH2AX的定量分析相结合而实现。具体而言，本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种基于高内涵技术定量分析焦油致细胞DNA损伤的方法，所述方法包括以下步骤：

1)细胞培养：将细胞接种在细胞培养液中进行细胞培养；

2)细胞染毒：吸弃所述细胞培养液，加入细胞染毒液继续培养，所述细胞染毒液包含焦油和细胞培养液；

3)免疫荧光标记：吸弃所述细胞染毒液，进行细胞中γH2AX的免疫荧光标记与细胞核的DAPI染色；

4)高内涵技术定量分析：分别进行所述细胞的细胞核和γH2AX的荧光测定，以所识别的有效细胞的有效细胞核内检测到的平均荧光强度来表征γH2AX的含量。

优选地，所述步骤1)中，所述细胞为贴壁生长细胞；更优选地，接种时，所述细胞处于对数生长期，以单细胞悬液接种于细胞培养液中；

更优选地，细胞接种后将细胞在细胞培养液中于37℃，5％CO₂条件下培养24h。

优选地，所述步骤2)中，所述焦油通过以下方法制备：标准卷烟样品于温度(22±1)℃和相对湿度60％±3％下平衡48-72后，抽吸该卷烟样品，收集总粒相物，然后加入DMSO(二甲基亚砜)配制成浓度为8-100mg/mL的烟气粒相物溶液(焦油)，-80℃下保存备用。根据本发明的具体实施方式，所述标准卷烟样品为3R4F。

优选地，所述细胞染毒液中焦油的浓度为0-500μg/mL，优选>0且≤500μg/mL，更优选为3.91-500μg/mL；

根据本发明的具体实施方式，所述细胞染毒液中焦油的浓度可以是0、3.91、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250或500μg/mL。

优选地，在所述细胞染毒液中培养细胞1-24h、优选24h。

优选地，所述步骤3)包括：

3-1)吸弃所述细胞染毒液，洗涤细胞，加入多聚甲醛进行细胞固定；

3-2)洗涤细胞，然后加入Triton-100X以使细胞通透；

3-3)洗涤细胞，然后加入血清白蛋白封闭，之后加入一抗即抗γH2AX抗体进行孵育；

3-4)洗涤细胞，然后加入免疫荧光标记的二抗进行孵育；

3-5)洗涤细胞，加入DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)进行染色；

3-6)洗涤细胞，保存。