[发明专利]一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的PCR检测方法

说明书

本发明涉及一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的PCR检测方法。提取水产养殖动物组织的总DNA；以所提取的DNA为模板，采用副溶血弧菌特异性引物，进行PCR扩增；所述的副溶血弧菌特异性引物是针对副溶血弧菌的recB基因的特异性引物P1或pyrH基因的特异性引物P2；根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断水产养殖动物是否被副溶血弧菌感染。本发明，使得水产养殖动物体内残留副溶血弧菌的检测更为简便，为今后水产养殖动物体内残留副溶血弧菌检测和分析提供了必要的理论依据和完善的方法体系，同时为我国水产品病原菌检测和我国食品进出口安全奠定基础。

技术领域

本发明属于病原微生物检测领域，具体的涉及一种养殖水产动物中常见的病原菌：副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)的PCR检测方法。

背景技术

副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)，是一种主要的食源性致病菌，嗜盐的革兰氏阴性细菌，属弧菌科弧菌属，广泛分布于沿海、河口环境和鱼、虾、贝等海产品中。同时副溶血弧菌是一种引起食源性疾病的重要病原菌，可导致患者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应。研究数据表明，50％～70％因食用海产品引发的腹泻病例是由副溶血弧菌引起的。

目前国内外对副溶血弧菌检测方法主要有细菌生化方法、免疫学检测方法、环介导恒温扩增技术、分析化学方法、分子生物检测法。但存在着检测方法复杂，灵敏性差等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种水产养殖动物体内残留副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)的PCR检测方法。本发明的方法可快速鉴定致病源，为我国水产品进出口安全提供技术支持。

本发明采用的技术方案是：一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的PCR检测方法，方法如下：

1)提取水产养殖动物组织的总DNA；

2)以所提取的DNA为模板，采用副溶血弧菌特异性引物，进行PCR扩增；所述的副溶血弧菌特异性引物是针对副溶血弧菌的recB基因的特异性引物P1或pyrH基因的特异性引物P2；

所述的特异性引物P1的上下游引物的序列是：P1-F:AGAAGAAGCGCCCGTTGAAG；P1-R:GCATGCAATCTGTGTGTCGG。所述的特异性引物P2的上下游引物的序列是：P1-F:AGTTATCGGTGGCGGTAACC；P1-R:GCCTGCTGAGAAGATTACAACG。

PCR反应条件：第一阶段：94℃5min；

第二阶段：94℃30s，61℃或62℃30s，72℃30s；30循环；

第三阶段：72℃5min；

第四阶段：4℃保存。

3)根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断水产养殖动物是否被副溶血弧菌感染。判断标准为，

针对特异性引物P1，如果PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果有212bp条带产生，则水产养殖动物被副溶血弧菌感染，否则没有被感染；

针对特异性引物P2，如果PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果有253bp条带产生，则大菱鲆被副溶血弧菌感染，否则没有被感染。

所述的水产养殖动物为大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾或三文鱼。

本发明的有益效果是：

1.本发明，设计的副溶血弧菌特异性引物，能有效从各常见致病菌株中区分出副溶血弧菌，表现出很强的特异性。