[发明专利]CPS1报告基因人肝细胞系及其构建方法与应用

权利要求书

1.CPS1报告基因人肝细胞系的构建方法，包括以下步骤：

1)构建携带靶向CPS1基因的单链向导RNA(sgRNA)编码序列的骨架载体sgCPS1；

2)构建CPS1基因的打靶载体CPSLR-2A-tdTomato；

3)将骨架载体sgCPS1和打靶载体CPSLR-2A-tdTomato转染到人肝细胞系中，经筛选获得稳定的tdTomato标记CPS1的CPS1-tdTomato报告人肝细胞系。

2.根据权利要求1所述的CPS1报告基因人肝细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中用于构建骨架载体sgCPS1的工具载体包括px458、px330、px461和px333，优选为pX458。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：以工具载体pX458为出发载体构建携带CPS1基因的单链向导RNA(sgRNA)的骨架载体，包括以下步骤：

1.1)设计靶向CPS1基因(GenBank号：1373)的sgRNA，根据CPS1 sgRNA序列获得CPS1基因的靶标序列AGCTGTGCAGAAATCTCGCA(位于CPS1基因自5’端第4759-4778位碱基)，根据CPS1基因的靶标序列获得CPS1 sgRNA编码序列，在CPS1 sgRNA编码序列两端加上Bbs I酶切序列，最终获得包含CPS1 sgRNA编码序列的寡核苷酸序列如下：

oligo1:5’-CACCAGCTGTGCAGAAATCTCGCA-3’(带下划线碱基为Bbs I酶切序列)，

oligo2:5’-TTTGACGCTCTAAAGACGTGTCGA-3’(带下划线碱基为Bbs I酶切序列)；

1.2)将合成的包含CPS1 sgRNA编码序列的寡核苷酸oligo1和oligo2进行退火并磷酸化；

1.3)将工具载体pX458用BbsI进行酶切，回收、纯化酶切工具载体pX458；

1.4)将退火及磷酸化的包含CPS1 sgRNA编码序列的寡核苷酸oligo1和oligo2连入经酶切的工具载体pX458中；

1.5)将连接产物转化DH5α感受态细菌，涂布于Amp⁺培养平板，37℃孵育过夜(16-20小时)；

1.6)从生长出的单克隆细菌中提取重组质粒，得到携带CPS1 sgRNA编码序列的重组骨架载体，命名为pX458-sgCPS1，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。

4.根据权利要求1或2或3所述的CPS1报告基因人肝细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中用于构建CPS1基因打靶载体的出发载体为包含tdTomato的原核表达载体，包括但不限于pET-tdTomato、pQE-tdTomato、pUC-tdTomato等，优选为pET32-tdTomato。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：以pET32-tdTomato为出发载体构建CPS1基因打靶载体，包括以下步骤：

2.1)获得CPS1基因的左臂插入片段(CPSL)和右臂插入片段(CPSR)，左臂插入片段(CPSL)的核苷酸序列如序列表中序列2所示，右臂插入片段(CPSR)的核苷酸序列如序列表中序列3所示；

2.2)用Kpn I和EcoR V对左臂插入片段(CPSL)及pET32-tdTomato载体进行双酶切，将两种双酶切产物进行连接，将连接产物转化DH5α感受态细菌，涂布于Amp⁺LB培养平板，37℃孵育过夜(16-20小时)，挑选单克隆生长细菌提取重组质粒，得到携带左臂插入片段(CPSL)的重组载体，命名为pET32-CPSL-tdTomato；

2.3)用Hind III和Sal I对右臂插入片段(CPSR)及pET32-CPSL-tdTomato载体进行双酶切，将两种双酶切产物进行连接，将连接产物转化DH5α感受态细菌，涂布于Amp⁺LB培养平板，37℃孵育过夜(16-20小时)，挑选单克隆生长细菌提取重组质粒，得到携带左臂插入片段(CPSL)和右臂插入片段(CPSR)的重组载体，命名为pET32-CPSLR-tdTomato，其核苷酸序列如序列表中序列4所示。