[发明专利]一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法及应用

权利要求书

1.一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，其特征在于，包括如下进行的步骤：

(1)预处理

取微生物发酵有机肥样品，加入PBS缓冲液、浸泡、离心、收集沉淀，重复上述的操作步骤，至离心后上清液无色，弃上清液，收集沉淀物，记为沉淀物Ⅰ；

(2)提取

在沉淀物Ⅰ中加入蒸馏水，重悬并离心，取上清液，然后向上清液中加入枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的混合液振荡混匀，于45-60℃水浴9-60分钟，离心，弃上清液，记为上清液Ⅰ，收集沉淀物；然后在收集的沉淀物中加裂解液和SDS溶液的混合液，并在温度低于25℃下使DNA复性，再次离心，取上清液，记为上清液Ⅱ，所述上清液Ⅱ中含有总DNA。

2.根据权利要求1所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，第一次加入PBS缓冲液的量相当于所述微生物发酵有机肥样品体积的3-15倍，浸泡不少于5分钟；其后每次在所得沉淀中加入PBS溶液，每200-300mg沉淀添加1-3mL PBS溶液。

3.根据权利要求1所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的混合液中枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的体积比2-5：1-3，所述枯草杆菌蛋白酶的初始浓度为20±2mg/ml，所述SDS溶液的初始浓度为0.1-0.2mol/L。

4.根据权利要求1所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述上清液Ⅰ与加入的枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的混合液体积比为1：10-20。

5.根据权利要求1所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述裂解液与SDS溶液的体积比为20-50：30，所述沉淀物Ⅱ与所述裂解液的体积比为1：10-20。

6.根据权利要求1所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述裂解液为Clelex-100。

7.一种简单快速检测微生物发酵有机肥的方法，其特征在于，以权利要求1-6任一项所得的上清液Ⅱ中总DNA为模板，采用特异性引物进行PCR扩增，所述特异性引物的上游引物16sF如SEQ ID NO：1所示，下游引物16sR如SEQ ID NO：2所示。

8.一种简单快速检测微生物发酵有机肥的试剂盒，其特征在于，至少包括PCR扩增引物，所述PCR扩增引物的上游引物16sF如SEQ ID NO：1所示，下游引物16sR如SEQ ID NO：2所示。

9.根据权利要求8所述的一种简单快速检测微生物发酵有机肥的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括枯草杆菌蛋白酶、细胞裂解液和SDS溶液。

10.根据权利要求9所述的一种简单快速检测微生物发酵有机肥的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PBS缓冲液。