[发明专利]通过容错性扩增解决等位基因扩增不平衡的方法

说明书

本发明公开了一种通过容错性扩增解决等位基因扩增不平衡的方法。该方法针对由于“在待测等位基因的引物与模板结合区存在碱基序列不匹配情况”而导致的等位基因扩增不平衡的情况，包括如下：改变原有PCR扩增条件来增强PCR扩增时引物的容错性。该方法可有效解决由于“在待测等位基因的引物与模板结合区存在碱基序列不匹配情况”而导致的等位基因扩增不平衡，重要优点是，对类似HLA的复杂基因进行PCR扩增时，即使引物序列上出现新的未知的多态性位点时，也能较好的进行扩增，减少等位基因扩增不平衡，有效避免其中一个等位基因扩增失败而导致的检测错误，而且还避免了针对引物结合区存在不同多态性位点时，需设计大量不同序列匹配引物进行扩增的难题。

技术领域

本发明属于基因扩增领域，涉及一种解决等位基因扩增不平衡的方法，具体涉及一种通过容错性扩增解决等位基因扩增不平衡的方法。

背景技术

PCR技术即基于聚合酶链式反应，是一种可以特异放大扩增特定基因片段的技术，可以使基因片段数万倍的增加。其原理的核心是寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合杂交，形成部分双链，在DNA聚合酶的作用下进行DNA合成。而寡核苷酸引物与单链DNA模板的结合是基于碱基配对原则：碱基配对遵循G(鸟嘌呤)：C(胞嘧啶)、A(腺嘌呤)：T(胸腺嘧啶)/U(尿嘧啶)的Watson-Crick碱基配对原则。

人体内每个细胞内有23对染色体，通常基因为双等位基因。进行普通PCR扩增时，两个等位基因一般情况下没有扩增效率的差异。但在复杂基因时，影响PCR扩增效率的因素会导致两个等位基因的扩增效率存在明显扩增差异，即等位基因扩增不平衡，严重时可出现一个等位基因扩增产量极少(扩增失败)，杂合的等位基因被错误的检测为纯合等位基因。例如HLA基因就是典型的复杂基因，具有高GC含量、高度同源性，高度多态性等特点。目前，HLA基因总数已经超过1万个，这些基因的有效扩增是HLA高分辨分型的重要基础。但以上特点决定了HLA基因的扩增引物设计特别困难以及扩增难度很高，容易出现HLA基因非特异扩增、等位基因丢失或等位基因扩增不平衡等问题，即相应基因扩增效率低或失败(扩增不平衡)使杂合基因位点丢失一个等位基因，分型错误为纯合基因位点。

当PCR引物与模板结合区域发生碱基错配时，会使核苷酸间结合能力下降，DNA双链结构不稳定，PCR扩增效率低下或扩增失败。当引物与一个等位基因匹配，而另一个等位基因不匹配，就会出现等位基因扩增不平衡现象。因此设计出序列匹配的引物成为PCR的关键因素。针对以上出现的等位基因扩增不平衡现象，现有技术采用如下策略进行解决：重新设计匹配的PCR引物。由于引物与模板结合区存在碱基序列不匹配情况，例如碱基突变等原因造成的等位基因扩增效率低，扩增不平衡时，重新设计与模板序列匹配的引物，这样就能解决扩增效率低下问题。

然而现有的解决方案存在着如下弊端：重新设计匹配的PCR引物，在面临高度复杂的基因，例如HLA基因，有大量的多态性位点，而且还有很多新的多态性(突变)位点没发现。如果采用发现一次引物与模板序列不匹配，就重新设计引物的策略，很快就会面临需要设计大量引物，引物设计极其困难的情况。特别是进行检测时，在引物结合区域出现从未发现的突变位点，很可能会导致严重的等位基因扩增不平衡现象，出现等位基因丢失，从而导致检测结果错误。

发明内容

本发明的目的是提供一种解决等位基因扩增不平衡的方法。

本发明所提供的解决等位基因扩增不平衡的方法，是针对由于“在待测等位基因的引物与模板结合区存在碱基序列不匹配情况”而导致的等位基因扩增不平衡的情况。具体可包括如下步骤：通过改变原有PCR扩增条件来增强PCR扩增时引物的容错性，从而解决等位基因扩增不平衡的问题；所述原有PCR扩增条件为：对所述待测等位基因进行PCR扩增，出现所述待测等位基因扩增不平衡情况时所采用的PCR扩增条件。

其中，所述改变原有PCR扩增条件为如下中的任一种或任几种：

(a)在对所述待测等位基因进行PCR扩增时，降低退火温度；