[发明专利]一种人血浆中小檗碱含量的定量检测方法

说明书

本发明公开了一种人血浆中小檗碱含量的定量检测方法，包括如下步骤：(1)血浆样品前处理过程；(2)随性标准曲线样品的制备；(3)LC‑MS/MS测定过程；(4)标准曲线及浓度计算方法。该方法采用沉淀前处理、LC‑MS/MS质谱仪对人血浆中小檗碱的含量进行测定，操作简单、分离效果好、定性准确、检测灵敏度高。

技术领域

本发明涉及分析技术领域，具体涉及一种人血浆中小檗碱含量的定量检测方法。

背景技术

小檗碱又名黄连素，是一种异喹啉生物碱，是从毛莫科黄连属植物黄连的根状茎中提取的主要有效成分，具有杭菌作用，对多种革兰阳性菌及阴性菌、结核杆菌和真菌均有抑制或杀灭作用，临床上一般使用其盐酸盐，临床用于清热解毒、治疗肠道感染与腹泻，疗效较好，较少副作用。近年来临床研究拓宽了小檗碱的适应症范围，研究发现小檗碱不仅有显著的降血糖作用，而且对糖尿病人伴有的合并症高血压、高血脂、血栓形成，对神经病变均有很好的防治作用，对人类肝癌细胞、艾氏腹水瘤、结肠癌细胞、食道癌细胞系、鼻咽癌细胞、膀胱癌细胞、恶性畸胎瘤细胞等都具有一定的抑制和杀灭作用，单用于降血压、降血脂，治疗心律失常、充血性心力衰竭、抗炎与免疫调节、抗肿瘤等也有显著疗效。随着小檗碱新的临床应用的拓展，为了临床用药的安全性和有效性，有必要对小檗碱在人体内的含量及其药代动力学进行研究，从而了解小檗碱的体内过程，确保用药安全。

由于液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)法可以克服背景干扰，对复杂样品仍可达到很高的灵敏度，且具有分辨率高、质量范围宽、扫描快等优点，LC-MS/MS已成为现代分析手段中必不可少的组成部分。因此本发明建立准确、可靠、高效的人血浆样品中小檗碱的含量LC-MS/MS检测方法，并将该方法应用于小檗碱的药物代谢动力学研究，为小檗碱的临床药用研究奠定技术基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人血浆中小檗碱含量的定量检测方法，该方法采用LC-MS/MS质谱仪对人血浆中小檗碱的含量进行测定，操作简单、定性准确、检测灵敏度高。

本发明的技术方案为：一种人血浆中小檗碱含量的定量检测方法，包括如下步骤：

(1)血浆样品前处理过程：取20.0～60.0μL人血浆样品，加入浓度为200ng·mL-1内标甲苯磺丁脲工作溶液，再加入200-400μL乙腈沉淀剂，涡旋混合3-5分钟，于3～8℃的离心机中高速离心3～5分钟，取上清液并向上清液中加入体积比1:1的甲醇水溶液，涡旋混合3～5分钟，进行LC-MS/MS分析；

(2)随性标准曲线样品的制备：等量取数份200-300μL人空白血浆，分别等量加入不同浓度盐酸小檗碱工作溶液5-15μL，涡旋混匀，逐级配制成盐酸小檗碱浓度在0.05-100ng·mL-1之间的校正标样及质控样品，分别注入LC-MS/MS中进行测定；

(3)LC-MS/MS测定过程：

a.液相色谱条件：色谱柱为UItimateXB C18；流动相A：含0.05％甲酸和10mM乙酸铵的水溶液；流动相B：乙腈；柱温箱温度：30～50℃；流速：0.2～0.8mL/min；色谱柱平衡状态时的柱压：250-400bar；洗脱方式为梯度洗脱；

b.质谱条件：离子源为ESI源，采用正离子模式、多反应监测模式；电喷雾电压：4500～5500V；涡旋离子喷雾温度：550～650℃；气帘气种类：30psi；碰撞池气体：中级；雾化气种类Gas1：45psi；辅助气Gas 2：65psi；数据收集时间：2～5min。

(4)标准曲线及浓度计算方法：根据步骤(2)所述校正标样的检测结果制作标准曲线，用步骤(2)所述质控样品的检测结果对标准曲线进行检测；所述标准曲线以盐酸小檗碱和内标甲苯磺丁脲的色谱峰面积比为纵坐标，以人血浆中盐酸小檗碱的浓度为横坐标，根据标准曲线计算人血浆样品中小檗碱的含量。