[发明专利]一种从藻体表面去除多糖和外源微生物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从藻体表面去除多糖和外源微生物的方法，属于藻体分离领域。

背景技术

藻体和微生物之间存在密切关系，微生物不仅附着在藻体的表面，还寄身于藻体的细胞内部。对于具有粘附性的外源微生物，藻类的表面为其生活和附着提供了生存条件，藻类分泌的糖类、脂类等代谢产物又能被细菌吸收利用，给细菌的生存提供营养。藻体脱落的部分也可以被外源微生物降解。反之，外源微生物能够产生一些胞外产物，如生长因子、维生素等，为藻类的生长发育做出贡献。因此，藻类与外生细菌之间既相互利用又拮抗，二者通过相互作用进行双向选择。

关于藻体和细菌之间的复杂关系，目前研究的主要方向有(a)藻类与藻际环境中微生物的相互关系：Miranda等人在2013年的一篇研究中做了全面的研究并提出一个猜想：微生物产生藻类，以紫菜属物种为研究对象，并推测和紫菜共存的一些细菌可能对于维持其形态结构和一些营养物质的生成存在不可或缺的作用。同时也有研究学者发现在绿藻和褐藻中也存在外源微生物影响藻体形态的现象。(b)藻类附生菌所产生的生物活性物质：许多学者致力于藻体附着外源微生物活性物质如毒素、抑菌物质和抗生素等等。（c）藻类附生菌的种群组成：为了研究藻类附生种群的类型，利用平板分离和16s扩增鉴定种群多样性（4）无菌藻种的获得：通过添加抗生素来抑制外源微生物的生长而获得无菌材料，或者是通过反复冲洗获得无菌材料。

随着测序技术的发展，基因组学的研究逐渐成为热门领域，然而对于海洋生物来说，外源微生物的存在成为制约其基因组学发展的一大障碍。许多学者致力于藻类无菌化的培养，然而比较成功的技术手段尚未见到相关报道。在藻类无外源微生物DNA污染的高质量DNA制备过程中，仍然存在很大的问题：1、目前的研究来看，藻类的DNA样本是一个高度复杂的样本，即提取的DNA中存在藻体本身的DNA同时也存在大量外源微生物的DNA，在基因组的拼接组装过程中很难利用生物信息学技术将外源微生物的DNA片段彻底去除，因此会影响基因组拼接组装的准确性，从而影响后续基因组特性的分析；2、藻类无菌材料的获得和维持是非常困难的，即使加入抗生素，也很难去除所含的细菌，推测某些细菌为其内共生微生物。

现有技术中对于无菌藻株的获得和维持仍然存在很大的问题。例如在利用抗生素抑制外源微生物的污染，有的物种长期加入抗生素就会产生抗性或者是不同的物种需要添加不同的抗生素类型。即使获得无菌的藻株，在无菌培养的过程中也很难维持。也有研究者利用超声波的方法反复冲洗样品，但这个技术的可重复性和操作性比较差。即使是除菌效果的检测，单纯的依靠平板培养也是不可靠的，因为90%的细菌是不可培养的。因此在目前藻类基因组项目的实施过程中，我们可以看到，一些学者是加入抗生素处理，而更多的是在获得基因组信息以后，从序列入手，包括和已有的外源微生物进行比对，根据相似性去除外源微生物的序列。或者是根据测序的覆盖度来剔除外源微生物的序列。这两种技术手段都存在弊端，有可能剔除不干净或者是将自己本身的基因组序列剔除掉。因此，在进行项目之前，就应该寻找一种从材料上解决外源微生物污染的方法。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明一种从藻体表面脱除多糖和外源微生物的方法，该方法结合藻类的特性，探索出一种降低藻类外源微生物污染的方法，其主要包括振荡前准备预处理、机械振荡、藻体孵育三个步骤，其不仅可以去除粘附在藻体表面的多糖，而且可以有效防止藻体表面附着的外源微生物的污染。总之，通过机械振荡的方法，可以有效的解决丛藻类表面多糖和细菌的问题，促进藻类基因组工作的开展。

本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：

一种从藻体表面脱除多糖和外源微生物的方法，其具体包括下述步骤：

1）振荡前准备：向研磨管内加入孔径为25-50目的石英砂0.05-0.15质量份，钢珠0.05-0.15质量份、玻璃珠0.05-0.15份，然后在再向研磨管中加入0.1质量份的藻体，向其中加入1体积份的无菌海水，混合均匀得到振荡材料；

2）机械振荡：将载有藻体的振荡材料在振荡仪上进行机械振荡，控制振荡转速在5000-6000rpm之间，振荡时间为5-30S；

3）藻体孵育：振荡完成后将材料取出置于0.05%吐温80缓冲液中孵育4-8min，使用无菌海水进行冲洗3-4次，然后将藻体置于无菌海水中，使用纱布过滤去除藻体表面的粘液，即可得到脱除多糖和外源微生物的藻体。