[发明专利]焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测KRAS基因12和13密码子低频突变引物及其应用

权利要求书

1.一种焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测KRAS基因12和13密码子低频突变引物，其特征在于，包括SEQ ID NO：1～2所示的扩增引物对、SEQ ID NO：3所示测序引物以及扩增阻滞引物，所述的扩增阻滞引物的5’末端最后两个碱基与扩增引物的上游引物3’端前两个碱基序列相同；

其中，SEQ ID NO：2其5’端标记生物素；

以上核酸序列在一次检测中共同使用。

2.根据权利要求1所述的焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测KRAS基因12和13密码子低频突变引物，其特征在于，所述的扩增阻滞引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，SEQ ID NO：4的3’端磷酸化处理。

3.一种焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测KRAS基因12和13密码子低频突变试剂盒，其特征在于，它包括如下试剂：

(1)DNA提取试剂；

(2)PCR反应试剂：PCR缓冲液，引物SEQ ID NO：1～4 10μM，MgCl₂ 2mM，KCl 50mM，dNTPs 0.2mM，Taq DNA聚合酶2U/μL；

(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2M NaOH，10mM pH 7.6三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；

(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP。

4.根据权利要求3所述的焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测KRAS基因12和13密码子低频突变试剂盒，其特征在于，所述的PCR缓冲液包括：0.1％(v/v)NP-40，0.02％(v/v)明胶，0.06％(w/v)g/mL BSA，0.1％(v/v)吐温-20，0.06M pH8.9N-三(羟甲基)甲基甘氨酸。

5.根据权利要求3所述的焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测KRAS基因12和13密码子低频突变试剂盒，其特征在于，所述结合缓冲液的配方如下：10mM Tris-HCl，2M NaCl，1mM EDTA，0.1％(v/v)Tween-20。

6.根据权利要求2所述的焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测KRAS基因12和13密码子低频突变试剂盒，其特征在于，所述退火缓冲液的配方如下：20mM pH 7.6 Tris-Acetate，2mM醋酸镁。

7.一种焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测KRAS基因12和13密码子低频突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取石蜡活检标本组织中的基因组DNA；

(2)以步骤(1)中所得基因组DNA为模板，PCR扩增包含KRAS基因12和13密码子核酸序列片段；

(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；

(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；

(5)测序得到SNP突变频率。

8.根据权利要求7所述的焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测KRAS基因12和13密码子低频突变的方法，其特征在于，步骤(2)中，

PCR扩增的体系为：10×PCR缓冲液5μL，SEQ ID NO：1 0.5μL，SEQ ID NO：2 0.5μL，SEQ ID NO：4 5uL，模板DNA 3μl，0.2mΜ dNTPs，2mM MgCl₂，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水补足至50μL。

9.根据权利要求7所述的焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测KRAS基因12和13密码子低频突变的方法，其特征在于，步骤(2)中，

PCR扩增条件为：94℃5min；50个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min，16℃终止反应。

10.权利要求1所述焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测KRAS基因12和13密码子低频突变引物在检测KRAS基因12和13密码子低频突变中的应用。