[发明专利]高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF及其构建和应用

说明书

高效产氢功能基因载体pET32a‑fdhF及其构建和应用涉及基因工程技术领域。pET32a‑fdhF基因载体为包含有蜡状芽孢杆菌甲酸脱氢酶fdhF基因的pET32a质粒。其构建是通过设计引物扩增蜡状芽孢杆菌中甲酸脱氢酶fdhF基因片段，并用重组酶将其连接到含有对应连接末端的pET32a片段中，进行基因测序，验证基因的完整性。将pET32a‑fdhF质粒转化到细菌中，在产氢培养基中培养此细菌生产氢气。pET32a‑fdhF能够应用于不同细菌中，既能使不产氢的细菌产氢，也能使产氢的细菌的产氢效率明显提高，消耗同样的底物浓度能产生更快更多的氢气。也能够改良现有工业产氢的大肠杆菌。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF及其构建和应用。

背景技术

随着煤炭、石油等化石能源的储备不断枯竭，急需发展新型能源，而氢能做为清洁且高热能的能源而备受关注。氢能源虽可通过化学方法得到，但因其成本高且可能造成的环境污染问题而受到争议，而生物产氢则能解决这个问题。生物产氢的微生物有很多，其中大肠杆菌产氢无论从成本还是从效率来看都是最佳选择之一。目前来看，野生的大肠杆菌不产氢或者产氢较少，无法满足人类对能源的需求，因此，基因工程或者代谢工程方法就被用来改造大肠杆菌使其产氢性能大量增加。现有的产氢大肠杆菌消耗底物多，但是产生的氢气比较少，效率还比较低，急需通过改造引入外源基因使其产氢效率大幅度提高，而不同的外源基因的产氢效率也有所差别。

发明内容

本发明的目的是提供一个高效产氢功能基因载体pET32-fdhF，及其构建方法。其能够应用于大肠杆菌BL21中，也能使产氢的细菌的产氢效率明显提高。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明提供一种高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF，其为包含有蜡状芽孢杆菌的甲酸脱氢酶基因fdhF的pET32a-fdhF质粒。(说明：将蜡状芽孢杆菌中甲酸脱氢酶基因fdhF进行克隆用于提高产氢量为本发明首创，选用pET32a为载体与甲酸脱氢酶基因fdhF进行重组也为本发明的创新)

本发明还提供了高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF的构建方法，主要通过使用clone smarter technology^TM试剂盒Seamless Assembly Cloning Kit完成重组反应，其原理如下式子所示：

(说明：选用Seamless Assembly Cloning Kit试剂盒的方法将载体pET32a与甲酸脱氢酶基因fdhF进行重组构建新的质粒的方法也为本发明的创新，该方法不同于以往采用T4连接酶连接基因片段与载体，可以避免在基因片段中间如果含有酶切位点则会被从中间切断的风险。而且此方法操作简便，省去双酶切、连接等步骤，简化了操作过程。例如，在本例中，外源基因连接到pET32a载体的位点选择的是NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，而克隆的fdhF基因内部也有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，如果用传统的酶切、连接方法，无法将完整的fdhF基因克隆到载体上。)

具体操作过程包括以下步骤：(1)线性化载体制备：使用pET32a为载体，使用双酶切方法获得线性化载体。根据pET32a上的酶切点设计引物，PCR扩增fdhF基因片段，其中，作为优选，所述甲酸脱氢酶基因的酶切位点为Nde I，XhoI。

(2)DNA片段制备：设计蜡状芽孢杆菌中甲酸脱氢酶基因fdhF的引物，并扩增甲酸脱氢酶基因fdhF。

(3)重组反应：通过加入重组酶，将准备好的线性化载体和fdhF基因片段连接起来，得到重组载体。

(4)转化：将构建好的重组载体转入感受态大肠杆菌DH5α中。