[发明专利]一种基于转录组序列开发绿绒蒿SSR引物的方法

权利要求书

1.一种基于转录组序列开发绿绒蒿SSR引物的方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)构建转录组文库：采用Trizol提取绿绒蒿花瓣总RNA，按照“TruSeq RNA Sample Preparation Guide”对纯化后的总RNA进行mRNA的分离、片段化、第一链cDNA合成、第二链cDNA合成，利用AMPure XP beads纯化cDNA；纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择；最后通过PCR富集得到cDNA文库；所建测序文库经2.0Fluorometer和Agilent2100系统检测合格后，在IlluminaHiSeq2000测序仪上完成双端测序；

(2)测序完成后，利用软件Trinity将测序序列拼接成一个完整的转录组，取每条基因最长的转录本作为Unigene，并对Unigene序列进行生物信息学分析；

(3)采用软件MISA1.0对上述Unigene进行SSR检测，进行单碱基、三碱基、四碱基、五碱基、六碱基重复SSR位点和混合SSR位点进行搜索；

(4)采用软件Primer3进行SSR引物设计，并鉴定引物的多态性；SSR引物设计使用的参数为：引物长度18-22bp，GC含量为30％-70％，退火温度为50-70℃，Tm55-65℃，产物大小100-300bp；

(5)SSR引物对采集自不同地理位置的8种绿绒蒿的DNA多态性进行鉴定；

(6)从开发的13356对SSR引物中合成适合扩增，且不重复的96对SSR引物；

(7)选取特定样品进行第一轮引物筛选，具体为：

(7a)选取差异性大的样品8个，分别是全缘叶绿绒蒿、多刺绿绒蒿、总状绿绒蒿、大花绿绒蒿、绿绒蒿蓝花铃蔻、绿绒蒿紫花铃蔻、秀丽叶绿绒蒿和横断山绿绒蒿；用选取的不同引物进行扩增，体系如下：酶mix：7.5ul；正向引物加接头：1ul，浓度10P；反向引物：1ul，浓度10P；DNA模板：1ul；ddH2O：4.5ul；扩增条件：94℃5min，94℃30S，63℃30S，共30个循环；72℃20S，72℃10min，4℃；

(7b)将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用2ul样品+6ul溴酚蓝，300V电压下12分钟，获取鉴定胶图；

(7c)根据胶图确定是否扩增出目的DNA片段，选取了21对扩增条带较好的引物准备二次扩增；

(8)二次扩增及二次筛选：用带荧光的接头引物和反向引物对一次扩增的产物进行二次扩增，扩增体系及条件与一次相同；将上步获得的PCR产物进行电泳鉴定，获取鉴定胶图；通过胶图确定模板浓度，加水稀释到电泳所需浓度；上机毛细管电泳及结果获取：(8a)将HiDi与500bp的内标按130：1混合，配成mix；(8b)用国产96孔反应板分装mix，每个孔中加入10ulmix；(8c)对应着在96孔板中加入0.5ul样品模板，离心到4000rpm即停；(8d)用金属浴加热器将混合板95℃加热预变性5分钟，拿出后立即放入-20℃；(8e)冷却后拿出，4000rpm离心，解冻、混匀；(8f)上3730测序仪进行毛细管电泳；(8g)获取下机结果并分析，筛选出多态性较好的位点；

(9)位点分析和筛选：共筛选出21对引物，分别如下：