[发明专利]一种用于三维生物打印的人脂肪间充质干细胞共混物和三维生物打印人体骨组织的方法

权利要求书

1.一种用于三维生物打印的人脂肪间充质干细胞共混物，其特征在于，其包含人脂肪间充质干细胞、海藻酸钠、明胶干粉以及作为溶剂的生理盐水的混合物。

2.根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞共混物，其特征在于，所述混合物中，海藻酸钠的浓度为15-25g/L，明胶的浓度为75-85g/L, 人脂肪间充质干细胞密度为0.5×10⁶-2×10⁶个/mL。

3.根据权利要求1或2所述的人脂肪间充质干细胞共混物，其特征在于，所述混合物中海藻酸钠的浓度为20g/L，明胶的浓度为80g/L, 人脂肪间充质干细胞密度为1×10⁶个/mL。

4.根据权利要求1或2所述的人脂肪间充质干细胞共混物，其特征在于，所述人脂肪间充质干细胞是将购买的人脂肪间充质干细胞中加入增值培养基进行传代培养后收集的第四代种子细胞。

5.根据权利要求4所述的人脂肪间充质干细胞共混物，其特征在于，所述增殖培养基为DMEM+10%胎牛血清+1%青、链霉素。

6.一种利用权利要求1所述的用于三维生物打印的人脂肪间充质干细胞共混物三维生物打印人体骨组织的方法，其特征在于，该方法包括：

传代培养：将人脂肪间充质干细胞置于增值培养基中进行传代培养；

制备人脂肪间充质干细胞共混物：将海藻酸钠与明胶干粉分别用生理盐水溶解，混合后制成混合溶胶，上述传代培养后的第四代人脂肪间充质干细胞加入到混合溶胶中，搅拌均匀后得到人脂肪间充质干细胞共混物；

设计打印物形状：参照传统组织工程学支架结构将打印体设计为多孔网络结构；

三维打印成型：将上述人脂肪间充质干细胞共混物置于三维生物打印机的料盒中，打印成预先设计好的结构，得到打印成型的组织结构；

交联处理：将上述打印成型的组织结构用CaCl₂和KCl₂的混合溶液对其进行交联，得到打印人体骨组织。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，该方法还包括对传代培养后的第四代人脂肪间充质干细胞成骨分化能力的鉴定：待第四代人脂肪间充质干细胞生长至70%-80%汇合后接种至六孔板，加入成骨培养基，成骨诱导7天后，进行碱性磷酸酶染色，以细胞胞质呈现蓝紫色判断为阳性；成骨诱导14天后，进行茜素红矿化结节染色，PBS冲洗细胞三次，体积分数为95%冰乙醇固定30分钟；蒸馏水冲洗3次，每孔加1ml茜素红染液，常温放置，染色20-30分钟；染色结束后洗去染液，蒸馏水冲洗，以细胞间质出现红染结节判断为阳性。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述成骨培养基为DMEM+10%胎牛血清+1青、链霉素+10mmol/Lβ-磷酸甘油+200mmol/L抗坏血酸+100nmol地塞米松。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，制备人脂肪间充质干细胞共混物具体步骤为：将购买的人脂肪间充质干细胞加入增值培养基中，置于体积分数5%的CO₂、37℃细胞培养箱培养至6-8天，细胞生长至70%-80%汇合状态后，进行细胞传代，每个培养皿中的细胞依次经过胰酶消化、中和、离心和重悬后，接种至3个培养皿中，6-7天汇合度达到80%-90%后，再次进行传代；传代两次后的标记为P4，作为种子细胞待用。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，三维打印成型过程中，具体参数如下：打印温度15℃，打印喷头直径250μm，打印微丝直径200μm，微丝中心间距400μm；打印时打印喷头运动，将喷出的共混合物拉成丝状，沉积到载有无菌细胞培养皿的平台上，逐层完成打印。