[发明专利]一种特异识别细菌脂多糖的广谱核酸适配体及其定向筛选方法

说明书

本发明提供一条能识别多种不同革兰氏阴性菌来源的脂多糖广谱性核酸适配体。该核酸适配体是基于免标记靶标分子、固定化核酸文库的capture‑SELEX技术基础上定向筛选获得的。即以鼠伤寒沙门氏菌脂多糖为唯一靶标，利用生物素‑亲和素作用将随机寡核苷酸文库通过生物素化的短互补链固定在亲和素包被的Fe₃O₄磁性纳米颗粒上，经过孵育、分离、扩增、酶切制备单链、克隆测序等步骤，当文库富集到一定程度后，再加入沙门氏菌和大肠杆菌完整的活性菌作为定向分子进行定向筛选，经过共15轮的反复筛选最终获得一条能识别四种脂多糖的广谱性核酸适配体。该核酸适配体能应用于饮用水、食品或临床医学等方面脂多糖的分析检测、分离富集和毒性中和等。

技术领域

本发明涉及食品安全与检测、临床医学等领域，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)定向筛选一条脂多糖的广谱性核酸适配体，它能特异识别鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌及铜绿假单胞菌等4种细菌来源的脂多糖，为该核酸适配体在食品、药品及生物制品中脂多糖的分析检测、分离富集和毒性中和等方面的应用提供科学依据和理论基础。

背景技术

脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)，又名内毒素(Endotoxin)，是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要成分。它主要由Lipid A，核心多糖和O-特异性多糖重复单元三部分组成，其中Lipid A是脂多糖的活性和毒性中心，位于外模的内侧，具有高度的保守型，而决定LPS抗原性的O-特异性多糖链位于外膜的外层，暴露于细胞表面，结构不稳定，核心多糖则位于两者中间，起连接作用。不同细菌来源的脂多糖结构不尽相同，毒性也不同，但是均具有相似的Lipid A结构。LPS在体内可通过细胞信号转导系统激活单核巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞等，合成或释放出多种细胞因子和炎症介质，从而引起机体一系列的反应，如发烧、腹泻、休克、败血症、多器官衰竭甚至死亡。当菌体溶解或被杀灭死亡后，脂多糖被大量释放到周围环境中，因此它广泛存在于日常生活种的饮用水、食品、药品及生物制品中，严重危害了产品质量和人民的健康安全。

目前，传统的内毒素检测方法主要有家兔热源检查法、鲎试剂法(LAL法)等，但是该类方法主要是基于酶催化反应的，因此在实际样品检测中容易受到蛋白酶等酶的影响而导致结果不准确，同时检测耗时长，灵敏度低，不能满足快速灵敏的市场需求。另外，由于细菌死亡溶解导致LPS的释放，其污染难以避免，尤其是生物制品和最终产品中。因此发展快速、高效、灵敏的脂多糖检测方法具有重要的意义。近年来，一些基于特异性识别LPS分子的生物传感器如蛋白生物传感器(LBP结合蛋白、CD14、rFC)、多肽生物传感器(PmB)、抗体生物传感器等在脂多糖检测方面得到了初步应用。这些检测方法虽然提高了检测的灵敏度，但是这些蛋白分子特异性不强，容易与其他分子结合，从而影响了检测结果的准确性；多肽的设计和制备成本高，同时检测过程较复杂；而抗体制备需要进行动物实验，同样存在时间长、成本高的缺点。

核酸适配体是利用上世纪90年代初发展的一种新的组合化学技术——SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，指数富集的配体系统进化技术)技术通过孵育、分离、扩增等反复多轮筛选得到的一段具有特定复杂三维结构并能特异性结合靶标分子的单链DNA或RNA序列。作为一种新型的仿生识别分子，核酸适配体能选择性地特异结合靶标分子。由于其具有靶分子范围广、可体外化学合成、稳定性好、制备及修饰方便、成本低等优点，近年来在疾病治疗、医疗诊断、环境检测和食品安全等方面的应用引起了广泛的关注。