[发明专利]核酸的等位基因特异性扩增

权利要求书

1.一种靶序列变体的等位基因特异性扩增的方法，其中所述扩增涉及聚合酶链反应（PCR），所述靶序列以几个变体序列的形式存在，所述方法包括

（a）使第一种和第二种寡核苷酸与靶序列杂交；其中第一种寡核苷酸与靶序列至少部分互补，并且第二种寡核苷酸在其3'-部分和5'-部分与靶序列至少部分互补，并且具有与靶序列的仅一个变体互补的至少一个选择性核苷酸，其中所述选择性核苷酸在接近所述第二种寡核苷酸3'末端的1 – 5个核苷酸之间的位置上，且其中所述第二种寡核苷酸包含具有在环外氨基上共价修饰的碱基的至少一个核苷酸，其中所述环外氨基是在腺苷的6-位置、鸟苷的2-位置或胞苷的4-位置中的氨基；

（b）为所述第一种和第二种寡核苷酸与靶序列的至少一个变体杂交提供适合于通过核酸聚合酶的寡核苷酸延伸的条件，其中在所述第二种寡核苷酸与互补于所述选择性核苷酸的靶序列的所述变体杂交时，所述聚合酶能够优先延伸所述第二种寡核苷酸，并且在所述第二种寡核苷酸与不互补于所述选择性核苷酸的靶序列的所述变体杂交时，基本上更少；和

（c）重复杂交和延伸步骤顺序多次。

2.权利要求1的方法，其中步骤（b）中的所述核酸聚合酶能够在所述选择性核苷酸与所述靶形成碱基对时唯一地延伸所述第二种寡核苷酸。

3.权利要求1的方法，其进一步包括检测步骤（c）中的引物延伸产物的步骤（d）。

4.权利要求1或2的方法，其中所述核酸聚合酶选自Taq DNA聚合酶、Z05 DNA聚合酶、ΔZ05 DNA聚合酶和ΔZ05-Gold DNA聚合酶。

5.权利要求1的方法，其中所述核酸聚合酶具有3’-5’核酸酶活性。

6.权利要求5的方法，其中所述核酸聚合酶选自Pfu DNA聚合酶和海栖热袍菌（Thermatoga Maritima）。

7.权利要求1的方法，其中步骤（a）中的所述序列变体是人BRAF、EGFR、PIK3CA或KRAS基因的V600E突变。

8.权利要求1的方法，其中所述第一种寡核苷酸是SEQ ID NO：11。

9.权利要求1的方法，其中所述第二种寡核苷酸选自SEQ ID NOs：2、3、4、5、7、8、9、10和17。

10.一种检测靶序列变体的方法，所述靶序列以几个变体序列的形式存在，所述方法包括

（a）使第一种和第二种寡核苷酸与靶序列杂交；其中所述第一种寡核苷酸与靶序列至少部分互补，并且所述第二种寡核苷酸在其3'-部分和5'-部分与靶序列至少部分互补，并且具有与靶序列的仅一个变体互补的至少一个选择性核苷酸，其中所述选择性核苷酸在接近所述第二种寡核苷酸3'末端的1 – 5个核苷酸之间的位置上，且其中所述第二种寡核苷酸包含具有在环外氨基上共价修饰的碱基的至少一个核苷酸，其中所述环外氨基是在腺苷的6-位置、鸟苷的2-位置或胞苷的4-位置中的氨基；

（b）为所述第一种和第二种寡核苷酸与靶序列的至少一个变体杂交提供适合于通过核酸聚合酶的寡核苷酸延伸的条件；其中在所述第二种寡核苷酸与互补于所述选择性核苷酸的靶序列的所述变体杂交时，所述聚合酶能够优先延伸所述第二种寡核苷酸，并且在所述第二种寡核苷酸与不互补于所述选择性核苷酸的靶序列的所述变体杂交时，基本上更少；

（c）重复杂交和延伸步骤顺序多次；和

（d）检测所述寡核苷酸延伸的产物，其中延伸表示所述第二种寡核苷酸对其具有互补选择性核苷酸的靶序列变体的存在。

11.一种用于靶序列的等位基因特异性扩增的试剂盒，其中所述扩增涉及聚合酶链反应（PCR），所述靶序列以几个变体序列的形式存在，所述试剂盒包括：

（a）与靶序列至少部分互补的第一种寡核苷酸；

（b）具有与靶序列的仅一个变体互补的至少一个选择性核苷酸、在其3'-部分和5'-部分与靶序列至少部分互补的第二种寡核苷酸，其中所述选择性核苷酸在接近所述第二种寡核苷酸3'末端的1 – 5个核苷酸之间的位置上，且其中所述第二种寡核苷酸包含具有在环外氨基上共价修饰的碱基的至少一个核苷酸，其中所述环外氨基是在腺苷的6-位置、鸟苷的2-位置或胞苷的4-位置中的氨基；和

（c）核酸聚合酶、三磷酸核苷、适合于通过所述核酸聚合酶的核酸延伸的缓冲液和用于执行等位基因特异性扩增的一组说明书。