[发明专利]一种无机‑有机比率荧光探针及其在半胱氨酸和同型半胱氨酸检测中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种无机-有机比率荧光探针及其在半胱氨酸和同型半胱氨酸检测中的应用。

背景技术

作为生物体内重要的含巯基生物小分子，半胱氨酸（Cys）和同型半胱氨酸（Hcy）在维持机体氧化还原平衡起着至关重要的作用。半胱氨酸含量缺失会引起毛发色素脱失、组织浮肿、嗜睡、肝脏损伤，皮肤损害，儿童生长缓慢等疾病。同型半胱氨酸水平也被证明与一系列疾病有关，包括癌症、老年痴呆症、心血管疾病等。因此，发展快速、灵敏、准确的检测半胱氨酸和同型半胱氨酸的分析方法，对于多种疾病的诊断具有重要的意义。基于荧光法高灵敏度、高选择性、快速的响应时间以及非生物破坏性等优点，在半胱氨酸和同型半胱氨酸检测方法中受到广泛的关注。

目前，基于不同机理用于检测半胱氨酸和同型半胱氨酸的有机荧光探针被广泛研究，主要包括迈克尔加成反应、与醛基进行成环反应、磺酰胺键断裂反应以及其他的一些反应机理。然而，大多数已报道的荧光探针是基于单发射波长的检测实现的，由此可能因生物背景干扰而产生“假阳性”的结果。

作为一种新型的荧光无机纳米材料，金纳米簇（AuNCs）因其高的光致发光特性、良好的生物相容性、低的细胞毒性，在生物成像和生物传感等领域得到广泛的应用。牛血清白蛋白（BSA）为模板合成的金纳米簇具有优良的荧光性能，能够在可见光下激发（400-520 nm）并具有较大的斯托克斯位移（发射波长630 nm左右）。由于其良好的光稳定性、生物相容性和低细胞毒性，使得BSA包裹的金纳米簇具有荧光成像的潜力。因此，通过构建无机-有机比率荧光探针，能够提供一个内置的校正而避免环境效应的干扰。

发明内容

本发明的目的是提供一种无机-有机比率荧光探针及其在半胱氨酸和同型半胱氨酸检测中的应用。

本发明构建了单激发波长激发来实现双发射波长的荧光探针。以4-氯-7-硝基-苯并呋咱为荧光团与对甲基苯硫酚反应合成硫醚取代的硝基苯并呋咱有机荧光探针，通过亲核取代反应实现对半胱氨酸和同型半胱氨酸的检测。采用BSA为模板合成具有荧光性质的金纳米簇，并在其表面氨基和羧基进行修饰。合成硫醚取代的硝基苯并呋咱有机分子含有的氨基，通过酯化反应与金纳米簇表面羧基反应，构建无机-有机复合荧光探针。单独无机-有机复合探针表现出金纳米簇的荧光，发射波长在630 nm处，与半胱氨酸和同型半胱氨酸反应后，探针通过有机分子对半胱氨酸和同型半胱氨酸的“OFF-ON”响应，在540 nm处产生新的荧光峰，而金纳米簇在630 nm处的荧光在反应前后具有良好的稳定性，通过单激发波长实现了双发射波长检测的目的。与传统单波长检测的荧光探针相比，通过双发射波长测定的比率荧光探针，能够提供一个内置的校正而避免环境效应的干扰，从而提高检测的准确性。此外，无机-有机比率荧光探针具有高选择性、良好水溶性、较低检测限以及良好生物相容性，使得荧光探针成功地应用于HeLa细胞中半胱氨酸和同型半胱氨酸的生物成像。

一种无机-有机比率荧光探针，其特征在于该荧光探针通过以下步骤制备得到：

1）硫醚取代的硝基苯并呋咱有机化合物的合成：将4-氨基苯硫酚和三乙胺溶于无水四氢呋喃中，加入4-氯-7-硝基-苯并呋咱在氮气保护下加热回流1~6 h，待反应结束后用水稀释反应产物并用二氯甲烷萃取数次，合并有机相，用无水硫酸镁干燥即得粗产物，然后将粗产物进行柱色谱分离即得硫醚取代的硝基苯并呋咱有机化合物；

2）无机-有机比率荧光探针的制备：将牛血清白蛋白为模板制得的金纳米簇用磷酸缓冲盐溶液（PBS）稀释10倍，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）和 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）反应15 min，随后加入硫醚取代的硝基苯并呋咱有机化合物的N, N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液，在室温搅拌反应12 h，最后将反应产物在PBS缓冲溶液中透析24 h即得无机-有机比率荧光探针。

所述4-氨基苯硫酚、三乙胺和4-氯-7-硝基-苯并呋咱的摩尔比为1：1~3：1~2。

所述柱色谱分离的条件：二氯甲烷为洗脱剂，硅胶为固定相。

所述EDC和 NHS在步骤2）反应溶液中的浓度均为10 mg/mL。

所述硫醚取代的硝基苯并呋咱有机化合物的N, N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液的体积占步骤2）反应溶液体积的10%。

所述透析用的透析袋的规格为MWCO: 3500。

所述无机-有机比率荧光探针在半胱氨酸和同型半胱氨酸检测中的应用，其特征在于具体步骤如下：