[发明专利]中性粒细胞弹性蛋白酶测定试剂及其制备方法

说明书

本发明揭示了一种中性粒细胞弹性蛋白酶测定试剂，包括R1试剂、R2试剂、校准试剂；R1试剂包括缓冲剂、反应促进剂、亲和素化胶乳微球、稳定剂，亲和素化胶乳微球的胶乳微球直径为50‑100nm；R2试剂包括缓冲剂、生物素化抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体、稳定剂；校准试剂包括定量的中性粒细胞弹性蛋白酶抗原。本发明还揭示了一种中性粒细胞弹性蛋白酶测定试剂的制备方法。本发明通过生物素化抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体与亲和素化胶乳微球结合，采用胶乳增强免疫比浊法来测定人体阴道分泌物和血清中NE的含量，该试剂操作简便，准确度高，重复性好，适于高通量检测，能够在全自动生化分析仪上使用，与酶免定量方法测定的结果有很好的符合性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种可采用胶乳增强免疫比浊法测定人血清和阴道分泌物中中性粒细胞弹性蛋白酶含量的中性粒细胞弹性蛋白酶测定试剂及其制备方法。

背景技术

NE(中性粒细胞弹性蛋白酶)存在于中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒中，是由218个氨基酸组成的单一肽链，分子质量大约25.9kD，含4个二硫键，是丝氨酸蛋白酶家族一员，因此与其他丝氨酸家族蛋白酶具有30％～40％的同源性，最适pH值接近中性。HNE的基因位于19号染色体的短臂末端，是50kb的DNA片段，成熟的中性粒细胞中并无HNE的mRNA表达，说明此种酶只在未成熟的骨髓细胞中合成。酶的催化中心由His 41、Asp 88和Ser 173三个氨基酸残基构成，空间位置相互靠近，均由发夹结构延伸到蛋白表面，其中Ser残基侧链上羟基具有很高的亲核性，容易结合不带电的小分子氨基酸，如Val、Ala、Leu、Met等。

NE属于基质金属蛋白酶类即MMP-12，是一种金属离子依赖性基质降解酶，需要微量Zn2+和Ca2+离子的存在才具有酶活性，其底物类型非常广泛，几乎可降解细胞外基质中的所有蛋白。白细胞、巨嗜细胞、肥大细胞内都存在着这种酶，中性粒细胞中其含量很高，大约每106个细胞中含有NE的总量为3μg。

生理条件下，NE可以协助清除异源性物质，促进吞噬细胞消除有害病菌，并帮助消化受损组织，有助于伤口的愈合与组织再生。而NE过量表达则会对机体组织、基质造成危害，表现为破坏血管壁组分，使中性粒细胞更容易渗出血管并向炎症部位趋化集中及释放IL-8、TNF-α等炎症因子；它还能降解细胞基质，催化caspase 3诱导的细胞凋亡。据报道，NE还能增强病毒、细菌及癌细胞对正常细胞的黏附能力，促进微生物的入侵及癌细胞的增殖和转移。

羊膜腔内感染或炎症与早产关系密切，特别是较早期的早产，而引起羊膜腔内感染的重要途径之一是经阴道、宫颈的上行感染。下生殖道感染时可使局部聚集、浸润大量炎性细胞如巨噬细胞，这些细胞被激活后释放多种炎性因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等，这些炎性细胞因子介导中性粒细胞聚集并被激活和脱颗粒，释放出NE，NE作用于宫颈组织，诱导局部组织细胞IL-8的基因与蛋白表达；NE的释放，加剧局部的炎症反应，促进更多中性粒细胞的聚集和活化，从而释放更多NE，参与对宫颈组织的细胞外基质的降解，促进早产的发生和发展。

NE的检测

NE是一种相对稳定的蛋白质，在8℃下保存三天仍具有稳定的免疫活性，在-15℃下标本可以保存至少3个月。目前仅有层析定性和酶免定量的检测方法可用，层析定性仅能在样本浓度超过检测限后简单确定有无，无法准确定量，不能反映炎症的轻重程度及对炎症进行及早的发现和治疗，而且存在较大的假阴或假阳，酶免方法主要是被科学研究者应用于科研，由于各自进行检测试剂的制备，没有统一的配方及工艺，没有对检测条件深入研究，导致不同批次试剂检测结果差异较大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中性粒细胞弹性蛋白酶测定试剂及其制备方法。

为实现上述发明目的之一，本发明采用如下技术方案：

一种中性粒细胞弹性蛋白酶测定试剂，包括R1试剂、R2试剂、校准试剂；