[发明专利]一种诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种胰岛样细胞的获取方法及其用途，尤其是一种诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法及其用途。

背景技术

糖尿病(DM,Diabetes Mellitus)是胰岛素分泌相对或绝对不足或胰岛素受体作缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱性疾病。临床上，I型及部分II型糖尿病多采用皮下注射胰岛素来治疗。细胞治疗是糖尿病尤其是I型糖尿病的理想治疗策略，对于己经丧失胰岛细胞功能的糖尿病患者来说，植入能分泌胰岛素的B细胞或其替代物是最理想的治疗方法。近几年，胰岛细胞移植治疗糖尿病取得了一些疗效，但供者细胞来源不足、严重的免疫排斥反应等困难却极大的限制了这种疗法的应用。

发明内容

本发明的目的在于基于上述技术背景而提供一种诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法，所述方法不存在伦理和免疫排斥限制，并且具有极高的诱导效率，有望成为诱导胰岛样细胞的种子细胞，提高了其在糖尿病治疗中的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(1)体外提取、鉴定并扩增T1DM患者的人疾病特异性尿源性干细胞(hUSCs)；(2)将hUSCs体外诱导为hUSCs源性的iPSCs(hUSCs-iPSCs)；(3)体外诱导hUSCs-iPSCs分化为胰岛样细胞(ILCs)。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤(1)中人疾病特异性尿源性干细胞(hUSCs)的体外提取方法为利用条件培养基筛选TIDM患者尿液中hUSCs。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤(1)中hUSCs的鉴定方法为流式细胞术、细胞免疫荧光、western blot或核型分析。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤(2)中将hUSCs体外诱导为hUSCs源性的iPSCs(hUSCs-iPSCs)的方法为逆转录病毒转染法。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述逆转录病毒为包含Oct3/4、Sox2、Nanog和Klf4四个基因的逆转录病毒质粒。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤(2)中将hUSCs体外诱导为hUSCs源性的iPSCs(hUSCs-iPSCs)的鉴定方法为细胞免疫荧光、RT-PCR、碱性磷酸酶染色或畸胎瘤实验。

另外，本发明还公开一种上述所述的诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法在治疗1型糖尿病中的用途。

本发明的诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法利用hUSCs来源丰富、取材无创、具备一定干性而易于转化的优点，将hUSCs重编程为iPSCs的高效诱导体系，并进而将hUSCs来源的iPS细胞诱导分化为胰岛样细胞，从而为自体干细胞治疗1型糖尿病提供新的种子细胞以及克服了伦理和免疫排斥限制，为治疗1型糖尿病提供了新的治疗方案。

附图说明

图1为本发明所述诱导人疾病特异性尿源性干细胞分化为胰岛样细胞的方法的整体技术路线图；

图2为本发明实施例1所述人疾病特异性尿源性干细胞(hUSCs)的获取、鉴定技术路线图；

图3为本发明实施例2所述hUSCs源性人iPSCs系的建立和鉴定的技术路线图；

图4为本发明实施例4所述Transwell共培养体系示意图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1尿源性干细胞的获取

尿源性干细胞的获取的技术路线如附图2所示，其具体步骤如下：

(一)体外提取并扩增1型糖尿病患者的尿源性干细胞(hUSCs)

通过导尿管在无菌条件下搜集1型糖尿病患者尿液，4℃保存。离心尿液，弃上清液，PBS冲洗细胞。用细胞计数器计数，台盼蓝排除法测量细胞活力。将 剩余细胞种植于24孔板，每孔约500个细胞，特殊培养基培养，2天换一次液。收集原代细胞用MTT试剂盒检测细胞增殖。

细胞形态学和表型分析，发现存在三类细胞：①终末分化细胞：此类细胞占99％，不能贴壁，可更换培养基去除；②正在分化细胞：至少有四种细胞，1-2个/100ml尿液，3-4周后逐渐减少，传代后不能继续生长，可传代去除；③USC：约2.5个/100ml尿液，此类细胞6周后可扩增到1亿个(第4代)。

(二)USC相关检测