[发明专利]编码生物膜形成抑制蛋白质的基因和使用具有失活基因的细菌菌株生产L-赖氨酸的方法

说明书

本发明涉及源自棒杆菌细菌的新的分离的基因(多核苷酸)，其编码具有生物膜形成抑制活性的蛋白质；其中多核苷酸失活的产L‑赖氨酸的菌株；和使用其生产L‑赖氨酸的方法。

本申请是分案申请，原申请的申请日为2014年10月15日，中国申请号为201410543331.X，发明名称为“编码生物膜形成抑制蛋白质的基因和使用具有失活 基因的细菌菌株生产L-赖氨酸的方法”。

技术领域

本发明涉及新的分离的基因，其编码具有生物膜形成抑制活性的蛋白质，和 通过使用其中该基因失活的细菌菌株生产L-赖氨酸的方法。

背景技术

细菌与其他微生物竞争养分，同时在各种生长条件下生长。当细菌的生长条 件不利并且威胁它们的生存时，细菌使用各种生存机制，包括生物膜形成。

生物膜是封装在自生产的细胞外聚合物基质的微生物的装配体，其充当协同 聚生体。生物膜用作保护屏障并且使得细菌在不利的条件下比如抗生素处理、宿 主免疫应答和抗菌剂下，作为群落在生物膜中存活。

据报道，随着细菌质量增加，L-赖氨酸生产产率下降。因此，问题是L-赖氨 酸生产产率取决于细菌质量的改变。

在许多实验之后，本发明的发明人已经成功鉴定了与生产L-赖氨酸的细菌菌 株中抑制生物膜形成相关的基因。他们也发现菌株的生长速度可通过失活该基因 而增加，导致细菌质量的增加。出人意料地，他们也发现尽管细菌质量增加，L- 赖氨酸生产的产率根本不减少，从而完成本发明。

发明内容

本发明的目标是提供新的分离的基因，其在产L-赖氨酸的菌株中编码具有生 物膜形成抑制活性的蛋白质；产L-赖氨酸的菌株，其中该基因被失活；和通过使 用具有失活的该基因的产L-赖氨酸的菌株生产L-赖氨酸的方法。

附图简述

图1显示从培养至静止期的革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌获得的在无细胞培 养发酵液处理之后NCgl0350基因(SEQ ID NO：2)的启动子表达水平生长允许试验 的结果。使用的革兰氏阴性细菌是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(At)、 大肠埃希杆菌(Escherichia coli)(Ec)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) (Pa)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(St)和哈维氏弧菌(Vibvrio harveyi) (Vh)，并且革兰氏阳性细菌是枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis Bacillus subtilis)(Bs)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)(Ca)、耻垢分枝杆菌 (Mycobacteriumsmegmatis)(Ms)、分枝杆菌菌株(Mycobacterium sp.strain)JC1 (MJC1)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(Sa)和枯草芽孢杆菌纳塔尔链 霉菌(Bacillus subtilisStreptomyces natalensis)(Sn)。

图2(a)显示制备用于测量与NCgl0350基因类似的铜绿假单胞菌PA5238的启 动子表达水平的pHS1004载体的方法，其中通过将启动子PA5238连接至pDN19lac Ω载体的无启动子lacZ基因的上游来制备载体pHS1004载体。

图2(b)显示PA5238的启动子表达与无细胞培养发酵液的浓度成比例诱导。无 细胞培养发酵液获自静止期的培养液，其中铜绿假单胞菌用pHS1004载体转导。

图2(c)显示用于测量在用pHS1004载体转导的铜绿假单胞菌中PA5238基因表 达需要的无细胞培养发酵液的处理时间。