[发明专利]一种血清型的大肠杆菌的培养方法

权利要求书

1.一种血清型的大肠杆菌的培养方法，其特征在于，所述血清型的大肠杆菌的培养方法，包括以下步骤：

原料采集：将屠宰后的鸡立即结扎胆管；

大肠杆菌筛选：无菌采集各胆内胆汁接种于麦康凯琼脂平板，同时另取胆内胆汁接种于普通肉汤增菌，经扩大培养后，挑选生长良好的菌落使用甘油保存；

毒素测验：以保存的大肠杆菌标株o8为阳性对照，用胆囊分离出大肠杆菌分别接种于葡萄糖、蛋白胨肉汤；增菌，培养后作兔肠结扎试验，判定结果；再进行小鼠的中长期注射毒性检测，筛选出对小鼠生长影响小的菌种；

胆汁存活筛选：取毒素测验步骤中分离菌种的肉汤培养物接种于牛胆汁中，培养，取存活菌落使用甘油条件下保存；

高浓度胆汁耐受筛选：用肉汤配制含牛胆汁的无菌培养基；使用胆盐配成无菌肉汤；取胆汁存活筛选步骤中分离菌的肉汤培养物和接种于胆盐牛胆汁琼脂中由低度胆汁到高度逐步培养驯化；重复胆汁存活筛选步骤；

将驯化得到的菌株分别进行牛胆囊动态生长模拟环境：取分离菌种的肉汤培养物分别接种于灭菌的牛胆汁中，上调和下调胆汁中的胆红素浓度；培养；取培养后的菌种涂布于麦糠凯琼脂平板培养；检测生长好的菌落对葡萄糖醛酸的利用情况进行再次筛选；

分离提纯：重复大肠杆菌筛选、毒素测验、胆汁存活筛选步骤，得到血清型的大肠杆菌。

2.如权利要求1所述的血清型的大肠杆菌的培养方法，其特征在于，所述大肠杆菌筛选具体包括：无菌采集各胆内胆汁0.01mL分别接种于麦康凯琼脂平板，同时另取1mL接种于普通肉汤增菌，37℃培养24～h 48h；

麦糠凯琼脂平板上出现直径约2mm～3mm、圆形、隆起、光滑、湿润的红色菌落视为可疑，麦糠凯无菌落生长、肉汤清亮透明者视为无菌，麦糠凯上无红色的菌落但是肉汤浑浊者再取0.1mL肉汤培养物转接于麦糠凯平板上37℃培养24h从麦糠凯培养基上挑选标准菌落，接种于普通培养基上，经扩大培养后，挑选生长良好的菌落使用甘油于4℃条件下保存。

3.如权利要求1所述的血清型的大肠杆菌的培养方法，其特征在于，

所述毒素测验具体包括：以保存的大肠杆菌标株o8为阳性对照，用胆囊分离出的26株大肠杆菌分别接种于1％葡萄糖、2％蛋白胨肉汤，于37℃增菌，培养36h后作兔肠结扎试验，每肠段注射菌液1mL，对照肠段注入普通无菌肉汤，判定结果；

进行小鼠的中长期注射毒性检测，筛选出对小鼠生长影响较小的菌种。

4.如权利要求1所述的血清型的大肠杆菌的培养方法，其特征在于，

所述胆汁存活筛选具体包括：取毒素测验步骤中分离菌种的肉汤培养物各1铂耳，分别接种于2mL灭菌的牛胆汁中，37℃培养24h后置于室温18℃下，后每隔24h取1铂耳涂布于麦糠凯琼脂平板，37℃培养24h；

平板上有多量密集的菌落为存活，少量稀疏菌落为生长不良，无菌落为生长死亡；取存活菌落使用甘油于4℃条件下保存。

5.如权利要求1所述的血清型的大肠杆菌的培养方法，其特征在于，所述高浓度胆汁耐受筛选具体包括：用肉汤配制含经高压灭菌后冰箱内保存的牛胆汁6％、10％、20％、40％、50％和100％的无菌培养基；

使用胆盐配成胆酸含量为0.25％、0.5％、1.25％、2.5％、6.0％、10.0％、20.0％、25.0％、30.0％和35.0％的无菌肉汤；

每管总量均为1mL；取胆汁存活筛选步骤中分离菌的肉汤培养物各0.05mL和接种于胆盐牛胆汁琼脂中由低度胆汁到高度逐步培养驯化；重复胆汁存活筛选步骤。

6.如权利要求1所述的血清型的大肠杆菌的培养方法，其特征在于，将驯化得到的菌株分别进行牛胆囊动态生长模拟环境，具体包括：

取分离菌种的肉汤培养物各1铂耳，分别接种于2mL灭菌的牛胆汁中，每6个小时上调和下调胆汁中的胆红素浓度1％，37℃培养24h后置于室温18℃下，后每隔24h取1铂耳培养后的菌种涂布于麦糠凯琼脂平板，37℃培养24h；平板上有多量密集的菌落为存活，少量稀疏菌落为生长不良，无菌落为生长死亡；检测生长较好菌落对葡萄糖醛酸的利用情况进行再次筛选。

7.一种利用权利要求1所述的血清型的大肠杆菌的培养方法培养的牛黄菌株。