[发明专利]一种直接对微小核糖核酸675(microRNA675)进行半定量的试剂盒

权利要求书

1.一种可直接对微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量的试剂盒，用于对总RNA中的某一种微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量检测，其特征在于：所述的一种可直接对微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量的试剂盒包含的一种具有“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”的探针和一种含DNA链置换酶的杂交缓冲液。

2.根据权利要求1所述的一种可直接对微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量的试剂盒，其特征在于：所述的一种具有“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”的探针由A、B链两条长度不同的寡核苷酸单链组装而成，A链较长，B链较短，其中A链核苷酸序列为SEQ ID NO.1： 5’ROX-GCCTCGGTGAGCGGTGAGGGCATACAGCCGAGGCT(-BHQ2)CTCCAGACGTCACTCAGTGCACC-3’， 序列中的ROX为荧光基团，BHQ2为淬灭基团；B链的核苷酸序列为SEQ ID NO.2：5’-GGTGCACTGAGTGACGTCTGGAGAG-3’；探针初始的“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”不是DNA链置换酶能够催化的空间结构，而变形后的一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构是DNA链置换酶能够催化的空间结构。

3.根据权利要求1所述的一种可直接对微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量的试剂盒，其特征在于：所述的一种含DNA链置换酶的杂交缓冲液，杂交温度在55-65 ℃之间，由Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase 32 U、MgSO4 10 mM、dNTP Mix 1 mM/种、Tris-HCl 20 mM、(NH4)2SO4 10 mM、KCl 50 mM组成，其中MgSO4 浓度可以在5-20 mM之间调整；在该杂交条件下，能够触发探针从初始“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”变形为一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构的唯一条件是探针的“多功能茎环结构”中的外环结构与微小核糖核酸675（microRNA675）发生特异性结合。

4.根据权利要求1或2所述的一种可直接对微小核糖核酸675（microRNA675）进行半定量的试剂盒，其特征在于：所述的一种具有“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”的探针的荧光基团与淬灭基团的修饰位置，荧光基团修饰在探针A链的5’端核苷酸上，淬灭基团修饰在5’端的互补位核苷酸或相邻的核苷酸上；这样修饰后，探针在初始的“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”时，荧光基团与淬灭基团空间距离小于10nm，将会发生荧光共振能量转移，导致荧光被淬灭，故探针在初始的“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”时，因此检测不到荧光。

5.当探针变形为一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构时，荧光基团与淬灭基团之间空间距离远大于10 nm，不能发生荧光共振能量转移，荧光基团不能被淬灭，故可检测到荧光；每当“靶序列的出现→与探针结合→探针变形→链延伸→链置换→靶序列重新游离”循环反应一次，被打开探针的量就增加一个靶序列原始量，靶序列的原始量越大，单位时间内发出荧光的探针量就越大，即荧光强度的累积速率与靶序列浓度成正比；因此，探针具有自身信号放大功能，极微量靶序列的存在也能够被检测到，不需要进行扩增。