[发明专利]一种人体抗AQP4自身抗体检测材料及其制备方法

说明书

本发明提供了一种人体抗AQP4自身抗体检测材料及其制备方法，先获取M1、M23亚型的AQP4全长目的基因，将其染入HEK293细胞中，构建出表达M1、M23亚型AQP4的HEK293/pCI‑neo‑M1‑AQP4细胞和HEK293/pCI‑neo‑M23‑AQP4细胞；再提取上述细胞中的AQP4‑细胞膜复合物；最后将AQP4‑细胞膜复合物固化在载体上，即得到人体抗AQP4自身抗体检测材料。本发明以提取的AQP4‑细胞膜复合物作为检测材料，可以减低造成背景着色的内源蛋白量，较目前使用细胞为检测材料进行的免疫荧光检测的方法进一步增加了检测灵敏度和特异性，使检测结果判读更加容易明确，能够简便快速的用于检测患者AQP4自身抗体。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种人体抗AQP4自身抗体检测材料及其制备方法，制得的检测材料能够用于检测人体抗AQP4自身抗体。

背景技术

人体自身抗体作为自身免疫疾病的重要血清标志物，其快速的检测对于自身免疫性疾病的诊断、治疗措施和预后有重要的应用价值。随着自身抗体检测的灵敏度和特异性提高，相关自身免疫性疾病的诊断标准也在相应更新调整。

视神经脊髓炎(neuromyelitis,NMO)是一种严重的中枢神经系统脱髓鞘疾病，约90％的NMO和一半以上的患者水通道蛋白4(aquaporin,AQP4)抗体阳性。2004年水通道蛋白4抗体的发现，为NMO成为独立疾病提供了客观证据，并在2015年被纳入改版的NMO诊断标准。

目前，患者血清或脑脊液内的AQP4自身抗体检测方法包括以下几类：1、使用高表达该抗原的神经组织切片进行免疫学实验(间接免疫荧光法，IndirectImmunofluorescence Assay,IIF)，来检测针对AQP4的自身抗体。此方法由于神经组织切片的制备较复杂，批次间的差异较大，难以质控；并且对检验人员的要求较高，需要检验人员有丰富的神经生理学知识，才能准确识别切片中阳性信号所在的部位及意义，因此实现商品化的难度较大。2、利用高表达抗原的细胞进行免疫荧光检测或流式细胞术(cell-basedassay,CBA)。但此类检测方法的主要缺陷在于：(1)细胞内多种蛋白可能引起背景着色问题。在具体检测过程中，尽管有空转对照细胞做对比，在外源抗原表达量较低时，部分检测结果仍不易明确判读。(2)操作过程复杂，各步骤是否准确操作直接影响检测结果，这非常依赖监测人员的经验，另外进行免疫荧光或流式细胞术实验时，需要特殊仪器，如荧光显微镜或流式细胞仪。3、使用重组抗原蛋白进行酶联免疫吸附法(ELISA)。AQP4做为膜蛋白，正确跨膜形成的空间构象结构对自身抗体的识别至关重要，在重组蛋白的表达过程中往往因为折叠翻译不正确，形成错误的构想，影响检测的特异性。另外，重组蛋白尤其是膜蛋白的分离纯化工作相当耗时、耗力。此外还有几种检测AQP4自身抗体的方法，此处不再例举。

目前，IIF和CBA法是抗AQP4自身抗体的常规检测方法。IIF法较CBA法敏感性及特异性相对较低，推测可能是因其反应底物存在种属间的差异引起。而CBA法通过构建稳定高表达人AQP4的细胞株做为底物，一方面避免了种属之间的差异，提高了该法的敏感性和特异性，另一方面检测材料的获取相对也容易。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人体抗AQP4自身抗体检测材料及其制备方法，该检测材料在基于细胞检测方法高灵敏性和特异性的前提下，能够进一步降低非特异信号，使检测结果判读更加容易明确，能够简便快速的用于检测患者AQP4自身抗体。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种人体抗AQP4自身抗体检测材料的制备方法，包括以下步骤：

1)获取M1、M23亚型的AQP4全长目的基因，通过pCI-neo质粒载体将目的基因分别转染入HEK293细胞中，构建出表达M1亚型AQP4基因的HEK293/pCI-neo-M1-AQP4细胞和表达M23亚型AQP4基因的HEK293/pCI-neo-M23-AQP4细胞；