[发明专利]一种高效的人皮肤组织多能干细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞工程领域，具体来说是一种高效的人皮肤组织多能干细胞的制备方法。

背景技术

源于成人组织的多能干细胞是组织工程和再生医学领域的重要来源，其易于获得，而且具有广泛的医疗应用前景。尽管胚胎多能干细胞在再生医学领域具有极大的潜力，但由于异种细胞移植的伦理问题，使其在临床上的应有受到限制。诱导多能干细胞(iPS)是另一个潜在的来源，然而iPS细胞具有潜在的致癌性，也使其在临床应用变得困难起来。

表皮干细胞是皮肤组织特异性干细胞，具有潜在多能性。其来源于胚胎的外胚层，有较原始的分化能力，具有非成熟细胞的特征，细胞体积小，细胞器少，处于静止状态，主要位于皮肤的基底细胞层，以及毛囊外根鞘隆突部。其具有多能性，可分化为神经细胞、脂肪细胞、软骨细胞等组织细胞。表皮干细胞在基因治疗、细胞治疗、组织工程中具有重要的研究和应用价值。关于表皮干细胞的研究研究已经成为生命科学和组织工程、再生医学领域研究的前沿之一。

尽管皮肤干细胞是一种重要的来源，然而，随着年龄的增长，人皮肤中的干细胞却随之减少，其分化能力也逐渐减弱。近来，有研究发现，来源于人脸颊或下巴的皮肤源性前体细胞与人眼睑、四肢、躯干的皮肤前体干细胞相比，其具有更显著的干细胞活性，具有更高的分化效率，这也表明了人脸颊和下巴皮肤作为组织工程和再生医学一个重要的干细胞来源，具有积极地应用前景。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中的细胞得率低、分化效率低的缺陷，提供一种高效的人皮肤组织多能干细胞的制备方法来解决上述问题。

本发明公开了一种高效的人皮肤组织多能干细胞的制备方法，具体步骤为：

一、包被瓶制备：

(1)、将人Ⅳ型胶原溶解并用PBS稀释至0.1g/L制成包被液；

(2)、取5ml包被液加入培养瓶中，平放，置4℃冰箱中过夜；

(3)、弃上清，置于超净工作台中干燥；

(4)、包被瓶置4℃冰箱中保存备用；

二、皮肤干细胞制备：

(5)、取脸颊或下巴皮肤组织，去除脂肪组织；

(6)、将皮肤切成0.5mm×0.5mm的小块，用PBS冲洗三次；

(7)、组织块置于无菌平皿中，真皮面朝下，用含有1U/ml中性蛋白酶Ⅱ的消化液，4℃，过夜消化；

(8)、用眼科镊子分离表皮，并弃之，然后将真皮层切成1mm³的小块；

(9)、用含体积分数为0.5％Ⅰ型胶原酶的消化液，于37℃，对真皮层小块轻摇消化1h；

(10)、再加入等量的DMEM/F12培养基，终止消化，再将细胞悬液以180g离心10min；

(11)将上述细胞悬液用过滤器过滤，去除残余的组织块，调整细胞密度为1×10⁵/ml；

(12)、将上述细胞悬液接种于包被有Ⅳ型胶原的T25培养瓶中，置于37℃、5％CO₂培养箱中，贴壁10-20min后，吸弃上清液，留用贴壁细胞；

(13)、再向T25培养瓶中加入10ml细胞培养液，置于37℃、5％CO₂的饱和湿度的培养箱中培养，每2-3天换液一次；

(14)、细胞融合度达到80％以上后，吸干培养液，用PBS液轻洗细胞两次；

(15)、培养瓶内加入体积分数为0.25％胰蛋白酶消化液+0.01％EDTA，置于37℃，5％的CO₂温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml细胞培养液终止消化；

(16)、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液180g离心，5min；

(17)、将上述细胞按1:3的比例分瓶传代，继续培养，细胞传至2-5代，即可。

作为优选，所述的步骤(7)中，所述的消化液为DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基中含有1U/ml中性蛋白酶Ⅱ、40U/ml硫酸庆大霉素、25μg/ml两性霉素B。

作为优选，所述的步骤(9)中，所述的消化液采用DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基中含有体积分数为0.5％Ⅰ型胶原酶、40U/ml硫酸庆大霉素、25μg/ml两性霉素B。

作为优选，所述的步骤(11)中，所述的过滤器的孔径为40μm。