[发明专利]一种高比活且具有较强降解生淀粉能力的淀粉酶突变体制备方法及其应用

说明书

一种高比活且具有很强的降解生淀粉能力的淀粉酶突变体及其制备方法和应用，涉及基因工程和遗传工程领域。本发明以来源于Talaromyces leycettanus JCM12802的酸性淀粉酶为母本，采用分子生物学技术将野生型进行了定点突变。在此改造条件下，淀粉酶突变体比母本野生型(突变前)的比活性有显著提高。利用此策略可以大大提高淀粉酶的比活及作用条件，为其在工业生产领域提供了基础。此策略对淀粉酶及其它酶的催化效率和比活提高具有重要的指导意义。

技术领域

本发明涉及基因工程和遗传工程领域，具体地涉及一种高比活淀粉酶突变体制备方法及其应用。

背景技术

淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。淀粉酶家族包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。α-淀粉酶为内切酶，以无规则的方式切开淀粉分子内部的α-1，4糖苷键，而使淀粉生成糊精和低聚糖，是一种钙离子依赖性酶。β-淀粉酶从非还原性末端顺次切下麦芽糖，为外切酶。葡萄糖淀粉酶是一种作用于α-1，4糖苷键的外切酶，从非还原糖末端切下葡萄糖分子。

淀粉水解酶是淀粉制糖工业的重要用酶。根据其在淀粉制糖工业中的应用可分为液化酶和糖化酶，而葡萄糖淀粉酶和麦芽三糖淀粉酶是重要的糖化酶。麦芽三糖淀粉酶可以催化降解淀粉生成高浓度的麦芽三糖。麦芽三糖作为一种优势特别明显的麦芽寡糖，被广泛地应用于焙烤、运动饮料和医药行业，受到越来越多的青睐。本研究挖掘新型的嗜酸麦芽三糖淀粉酶，为淀粉制糖工业提供性质优良的淀粉水解酶。

α-淀粉酶(EC.3.2.1.1)属于糖苷水解酶13家族，能够作用于可溶性淀粉、糖元、直链淀粉等α-1,4-葡聚糖，其水解淀粉的主要产物是一些由葡萄糖单位组成的低聚糖和糊精的混合物。α-淀粉酶广泛应用于食品、纺织和制药等工业。真菌α-淀粉酶主要来源于青霉属和曲霉属，但是自身的活性低,并达不到工业需求，而淀粉酶的异源表达还是个难题尤其是进行毕赤酵母异源表达，本文是从青霉属T.leycettanus JCM12802获得的淀粉酶基因截掉CBM20作为野生型后进行异源表达，通过定点突变获得高比活菌株高比活、高催化效率的淀粉酶工程菌株的获得主要通过诱变、筛选和酶分子改良获得。诱变分为自然突变和人工诱变，自然突变成功的几率非常小，人工诱变的工作量较大且有益突变频率仍然较低，变异的方向和性质难以控制。筛选的盲目性较大，不容易获得目的菌株。酶分子改良目的性强，针对酶分子具体结构分析进行改造，从而达到提高比活力和催化效率的目的。

发明内容

发明提供了一种高比活淀粉酶突变体的制备方法，是将野生型淀粉酶的223位的亮氨酸突变成苯丙氨酸得到的突变体。

本发明的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述突变体基因的重组菌株。

上述野生型活淀粉酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述高比活淀粉酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述野生型淀粉酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述高比活淀粉酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供一种制备所述高比活淀粉酶突变体的方法，其技术方案如下：

(1)将基因amy6插入质粒中，获得包含基因amy6的重组质粒，质粒优选pPIC9；

(2)采用北京全式金公司的Fast Mutagenesis System对上述重组质粒进行特异性点突变扩增获得高比活突变体质粒；