[发明专利]用于生产具有高活性脂肪酶的基因

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于生产具有高活性脂肪酶的基因。

背景技术

APROL(Rhizopus oryzae lipase)，源于Rhizopus oryzae，Amazon有商品化的脂肪酶基因。Minning et al.(2001)采用pPICαA/P.pastoris X-33表达系统对Rhizopus oryzae来源的基因并对其进行表达，发酵103h后酶活为12888U/L·h(Olive oil，在30℃pH 8.1下反应)，用pPICZaC/P.pastoris表达系统对其进行表达,发酵48h后酶活为110U/ml,8571U/mg(triolein，30℃pH 8.1)，native enzyme(10000U/mg,olive oil,pH 8.5,37℃)。但该酶活性不高，影响了其商业化推广或应用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的之一在于提供了一种用于生产具有高活性脂肪酶的基因；本发明的目的之二在于提供一种由所述基因所表达的高活性脂肪酶。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种用于生产具有高活性脂肪酶的基因，所述基因的序列如下：

一种由上述基因所表达的高活性脂肪酶，所述高活性脂肪酶的比酶活为380～430U/mg。

较佳地，所述高活性脂肪酶的比酶活为409U/mg。

应用上，所述高活性脂肪酶可用于增白面制品与烘焙制品，如面条、馒头等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的基因所表达的脂肪酶活性高、具有开发潜力，具有广泛和实际的应用价值，如可用于面制品与烘焙制品的增白。

附图说明

图1是本发明线性化质粒APROL-pPICZαA的琼脂糖电泳检测，其中，线M，DL15000bp marker；线1，线性化APROL-pPICZαA。

图2是BMMY-罗丹明B平板法筛选重组子的示意图。

具体的实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，以助于本领域技术人员理解本发明。

本发明用于生产具有高活性脂肪酶的基因(用APROL-pPICZαA表示)的序列如下：

一、基因的表达

寄主：毕赤酵母菌株X-33和GS115。当然，可表达脂肪酶基因的其他寄主都可应用至本发明。

基因合成：本发明用于生产具有高活性脂肪酶的基因由上海捷瑞公司合成。

1.1表达菌株构建

1.1.1质粒提取

参照广州东盛质粒小提试剂盒使用说明书。

1.1.2重组质粒APROL-pPICZαA的线性化和回收

将所得的重组质粒APROL-pPICZαA用Sac I进行线性化处理，37℃下酶切反应1h，反应体系如下：

将酶切反应溶液混匀后放置于37℃水浴，1h后取出，用凝胶纯化回收试剂盒进行回收(参见天根胶回收试剂盒使用说明书)。

1.1.3毕赤酵母菌株感受态的制备及电转化

参见Invitrogen的pPICZαA,B,and C用户操作手册。

1.1.4结果

将经酶切验证和测序验证后正确的重组质粒APROL-pPICZαA用Sac I进行线性化处理，酶切产物回收后用1％琼脂糖凝聚电泳进行鉴定，结果如图1所示。

1.2具脂肪酶活性的转化子的筛选

1.2.1初筛

挑取YPDS平板上生长最快的单克隆子分别点接于YPD(用于保种)和BMMY-罗丹明B平板(用于诱导)平板上，30℃倒置恒温培养3～5d；

每隔24h在BMMY-罗丹明B平板的盖子上添加100μL甲醇对重组子进行诱导表达，在培养过程中，根据水解圈的相对大小选出脂肪酶酶活性最强的10个转化子，依次编号为1#，2#，3#～10#，平板筛选结果如图2所示。

1.2.2复筛

将选定的10个转化子分别接种含10mL BMGY液体培养基中(100mL规格摇瓶)，30℃250rpm培养至OD600＝6.0；

3,000g离心5min收集菌体，用2mLBMMY液体培养基重悬细胞后转移至50mLBMMY液体培养基中，使其OD600＝1.0；