[发明专利]一种快速简易的基因多态性检测方法及试剂盒和应用

权利要求书

1.一种快速简易的基因多态性检测方法，该方法包括：

（1）将待测样品与样品处理液处理获得含有核酸的溶液；

（2）采用荧光定量PCR选择性扩增所述含有核酸的溶液中的目标核酸序列；

所述选择性扩增采用选择性扩增引物，所述选择性扩增引物能有效区分目标核酸序列变异体与非目标核酸序列变异体；所述选择性扩增引物包括突变型扩增引物、野生型扩增引物，其中突变型扩增引物和野生型扩增引物均包含以共价相连或直接相连的引物区序列和变异体识别区序列，所述引物区序列在3’端，变异体识别区序列在5’端，所述变异体识别区序列连接有核酸双链稳定因子或含有不能被核酸酶水解的修饰因子，所述引物区序列能够从目标核酸基因多态性位点前开始扩增，突变型扩增引物变异体识别区序列包含目标核酸基因多态性位点处的正常碱基，野生型扩增引物变异体识别区序列包含目标核酸基因多态性位点处的突变碱基，两种变异体识别区序列均与所述引物区序列扩增延伸产生的序列形成发夹结构；

同时对目标核酸序列进行基因型特异性选择性检测，根据PCR扩增结果的Ct值判断待测样品基因型；

所述样品处理液为处理缓冲液、金属离子络合剂和蛋白酶K，所述处理缓冲液为Tris-HCl缓冲液，浓度为10~100 mM，pH7.0~10.0；所述金属离子络合剂为EDTA，浓度为1~3mM，pH7.5~8.5；所述蛋白酶K浓度为0.01~20mg/ml。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述处理缓冲液与扩增检测体系兼容。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）为：将待测样品用样品处理液浸泡或混合，然后经56℃保温5min，98℃保温2min，获得含有核酸的溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述修饰因子包括碱基类似物、核酸骨架、脱氧核糖类似物、肽核酸或硫代磷酸酯。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸双链稳定因子包括锁核酸、肽核酸或DNA小沟结合物/类似物中的一种或一种以上的组合。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因型特异性选择性检测使用Taqman荧光检测探针检测，该探针对于不同基因型有差异性结合，从而实现差异性检测。

7.一种基于权利要求1至6任意一项所述方法检测基因多态性的试剂盒，包括样品处理液，目标核酸选择性扩增引物和目标核酸选择性检测探针；其中，所述样品处理液为处理缓冲液、金属离子络合剂和蛋白酶K，所述处理缓冲液为10~100mM，pH7.0~10.0的Tris-HCl，所述金属离子络合剂为1~3mM，pH7.5~8.5的EDTA，所述蛋白酶K的浓度为0.01~20mg/ml；所述目标核酸选择性扩增引物包括突变型扩增引物、野生型扩增引物和公共扩增引物，所述目标核酸选择性检测探针包括突变型检测探针和野生型检测探针；

所述突变型扩增引物和野生型扩增引物均包含以共价相连或直接相连的引物区序列和变异体识别区序列，所述引物区序列在3’端，变异体识别区序列在5’端，所述变异体识别区序列连接有核酸双链稳定因子或含有不能被核酸酶水解的修饰因子，所述引物区序列能够从目标核酸基因多态性位点前开始扩增，突变型扩增引物变异体识别区序列包含目标核酸基因多态性位点处的正常碱基，野生型扩增引物变异体识别区序列包含目标核酸基因多态性位点处的突变碱基，两种变异体识别区序列均与所述引物区序列扩增延伸产生的序列形成发夹结构。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR缓冲液、MgCl₂、去垢剂、DNA聚合酶和dNTP。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述dNTP为dATP、dCTP、dGTP和dUTP。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括UNG酶。