[发明专利]用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条技术，现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒。

背景技术

副结核病，也称副结核性肠炎，是由副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis，MAP)引起牛、羊、鹿以及骆驼等多种动物的一种慢性传染病。OIE将其列为B类疫病，我国将其列为多种动物共患的二类动物疫病。副结核分支杆菌主要感染牛、羊和鹿，发病动物和隐性感染者是主要传染源，它们可通过乳汁、粪便和尿排出大量的病原菌。本病的流行特点是发展缓慢，发病率不高，病死率极高，并且一旦在动物群中出现则很难根除。近年来我国养殖场副结核病的感染率有上升的趋势，一些养殖场依然没有重视该病的防控。由于副结核病引起患病动物消瘦、生产性能下降、增加饲料消耗及易感染其他疾病直至死亡，给养殖业造成的经济损失相当严重，因此，规模化牧场副结核病的检疫与净化显得非常重要。

目前，副结核病的诊断方法主要有病原学方法、变态反应和血清学方法，其中，病原学主要有萋-尼氏抗酸染色、分离培养、PCR技术、LAMP快速检测等。对于萋-尼氏抗酸染色而言，由于粪便样品中可能还有其他的抗酸菌，会干扰染色法的诊断结果；对于分离培养法而言，分离培养耗时费工，分离率也较低；PCR技术对仪器设备和技术人员依赖程度高，在基层条件差和技术人员匮乏的情况下，很难实现现场实地快速诊断；LAMP快速检测虽然可以进行核酸的恒等温扩增，但仍不能对核酸粗提物的DNA样本进行直接扩增。此外，现有的采用PCR和LAMP诊断副结核病的报道中，其设计引物所依据的保守基因序列有多种，有的以副结核分枝杆菌ISMav2基因(AF286339)的保守区域设计引物(“牛副结核分支杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立”，中国畜牧兽医，2012年第39卷第10期)；有的以牛副结核分枝杆菌的IS900基因序列作为靶基因设计特异性引物(“牛副结核分枝杆菌LAMP快速检测方法的建立”，中国预防兽医学报，2012年6月)，而根据不同的靶标(保守基因)设计的引物序列不同，对副结核分枝杆菌的诊断和检测效果也存在较大差异，因此，选择何种靶标作为引物设计的依据也是病原学法诊断副结核分枝杆菌的难点之一。

皮内变态反应能检测出副结核感染前期的大部分发病动物，但对于感染中后期以及处于耐受期的动物敏感性不强或者不出现反应状态。

动物在感染副结核分枝杆菌后的前期并不产生抗体，只有在临床症状阶段才产生抗体，所以使用血清学方法可能漏检副结核病阳性动物。

因此，从临床诊断的时效性方面考虑，亟需一种新的病原学现场快速恒等温扩增检测技术。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术是目前新出现的一种体外快速核酸扩增技术，在37℃左右就能发生反应，并且仅需十几分钟就能扩增出痕量级的检测产物。同时RPA可以完成核酸粗提物的扩增，它通过琼脂糖凝胶电泳，荧光扩增曲线和侧流层析试纸条(Lateral Flow Dipstick，LFD)三种方式检测结果，这三种方式的引物与探针反应原理是不同的。基本的RPA扩增只需上下游引物，产物通过凝胶电泳检测，而RPA-nfo和RPA-exo反应，是通过不同的探针结合到模板互补链后再通过核酸内切酶IV(nfo)和核酸内切酶III(exo)切割掉3'端阻止序列，这两种方法分别通过LFD(nfo)和实时荧光(exo)两种不同的手段检测结果。凝胶电泳和荧光扩增曲线法仍然依赖实验室和特殊仪器设备，而LFD是一种无需特殊仪器可用于现场的检测方法。将RPA技术与LFD技术结合，通过LFD读取结果，既不要求特殊仪器设备，也无需复杂的样品处理，借助恒温水浴锅用LFD就可以通过肉眼观察结果。但目前尚无文献报道利用RPA-LFD技术现场检测副结核分枝杆菌。

但RPA技术属于新兴的核酸扩增技术，其应用并不十分普遍，其主要技术难点在于特异性引物和探针的设计和筛选，而引物/探针的设计和选择对RPA-nfo的结果是至关重要的，目前并没有像PCR扩增技术那样专门的引物/探针的设计软件，也没有较多的文献和试验数据提供技术依据。经相关检索，目前还未有针对副结核分枝杆菌进行RPA-LFD检测的相关报道。

综上，对于副结核分枝杆菌的RPA-LFD检测，目前尚无明确可借鉴的思路和结果，还需要技术人员做大量和深入的研究。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒。