[发明专利]一种用于检测黄萎病菌的培养基及检测向日葵种子携带黄萎病菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测黄萎病菌的培养基（MNP-10）以及利用MNP-10对向日葵种子中携带的黄萎病菌进行特异性的分离和鉴定的方法。

背景技术

向日葵是一种起源于美洲的油料作物 , 广泛分布于欧洲、亚洲、美洲等地，目前已经成为世界第四大油料作物。近年来，由于国外向日葵育种材料和杂交种的大量引入，使得我国向日葵黄萎病呈现逐年加重的趋势。因此，向日葵黄萎病的发生严重影响向日葵的产量和品质，继而影响着我国向日葵产业的稳步发展。

向日葵黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的一种典型的土传病害，可以侵染多种寄主作物，造成产量和品质的严重下降。该病原菌寄主范围广，常以发病组织中残留的厚垣孢子、微菌核等作为来年的初侵染来源。目前，由于大丽轮枝菌能够侵染向日葵的花盘，从而使得种子可能成为携带黄萎病菌进行远距离的传播的载体。而这也可能是导致我国向日葵黄萎病发生面积不断加大的主要原因之一。已有的研究结果表明可以利用PDA培养基或滤纸法来分离种子上携带的黄萎病菌，但是由于上述的方法具有操作程序复杂、分离培养时间较长，在培养过程中很容易被杂菌污染等缺点，从而限制了它们的广泛应用。

2001年8月，杨家荣等在《置物病理学报》发表的《分离土壤棉花黄萎病菌选择性培养基的筛选》一文中公开了一种培养基由土壤浸提液、K₂HPO₄、KH₂PO₄、尿素酸钠、果胶、山梨糖、Dox盐、Tergitol NP-10，PCNB、琼脂、蒸馏水以及抗生素组成。此培养基用于黄萎病菌选择性培养以果胶和山梨糖作为复合碳源，尿酸钠有利于棉花黄萎病微菌核黑色素形成，PCNB有利于抑制白色菌丝状杂菌。本发明使用土壤浸提液，成分复杂难于控制体系成分。

发明内容

本发明提供了一种检测黄萎病菌的培养基，含有多聚半乳糖醛酸（Polygalacturonic acid，PGA），所述培养基以PGA作为唯一碳源，所述培养基由溶液I、溶液II和抗生素组成，所述溶液I为PGA的NaOH溶液，所述溶液II包括KNO₃、KH₂PO₄、KCL、MgSO₄·7H₂O、Tergitol NP-10和琼脂粉。本发明所提供的培养基是筛选性培养基，与常规培养基相比缺少了大量碳源成分，有利于抑制其他微生物的生长。PGA所提供的碳源是黄萎病菌生长扩繁必不可少的营养物质。

优选的是，每500mL溶液I中含有PGA 3g至10g和NaOH 4g，其余为水。NaOH的加入有利于PGA的溶解，增大溶液的pH。降低PGA的浓度能够明显降低菌株培养效率，但高浓度的PGA对菌株的培养效率没有很明显的影响。所述溶液I与溶液II混合后形成的培养基的最终的PH为7至10，优选为8至9，优选为8.5。

上述任一项中优选的是，每500mL溶液II中含有KNO₃1g、KH₂PO₄1g、KCL 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、 Tergitol NP-10 0.5 mL至1mL和琼脂粉15g，其余为水。KNO₃、KH₂PO₄、KCL、MgSO₄·7H₂O为黄萎病菌生长所必需的大量元素和微量元素。

上述任一项中优选的是，所述溶液I经过高压灭菌，灭菌条件为121℃，15min。

上述任一项中优选的是，所述溶液II经过高压灭菌，灭菌条件为121℃，15min。

上述任一项中优选的是，所述培养基是将溶液I和溶液II按照1：1的体积比混合而成。

上述任一项中优选的是，每500mL溶液I中含有PGA 5g。选用5g PGA/500mL溶液I既为菌落生长提供了最合适浓度的碳源，又节约了昂贵的试剂成本。