[发明专利]用于现场快速检测牛支原体的引物、探针及试剂盒

权利要求书

1.一种用于通过RPA技术检测牛支原体的引物对和探针组合，其特征是：其正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示，其中反向引物序列5’-端用生物素标记；探针序列5’-端用FAM标记，距离5’-端30个碱基的位置处设有dSpacer，3’ -端用C3-spacer阻断。

2.包括权利要求1所述的引物和探针组合的试剂盒。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征是：所述试剂盒还包括阳性质控标准品、阴性质控标准品和RPA反应液。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征是：所述RPA反应液包括recA重组酶、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、rehydration缓冲液、醋酸镁溶液、侧流层析试纸条、LFD检测缓冲液、TE缓冲液、SDS和蛋白酶K。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征是：所述阳性质控标准品包括牛支原体uvrC基因片段阳性质控标准品；所述牛支原体uvrC基因片段阳性质控标准品由含有如SEQIDNo.4所示的核苷酸片段构成的pEASY-T3重组质粒组成；所述阴性质控标准品为pEASY-T3空载质粒。

6.一种非诊断目的的检测牛支原体的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）检测样本DNA的提取或检测样本的现场裂解处理；

（2）以步骤（1）中处理的样本为模板，根据牛支原体的uvrC基因，设计特异性正向引物、反向引物和探针，进行RPA-nfo扩增；

（3）用LFD检测上述RPA-nfo扩增产物，根据检测结果判定样本中是否含有牛支原体。

7.如权利要求6所述的方法，其特征是：步骤（2）中所述的正向引物、反向引物探针依次如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示；步骤（2）中RPA扩增反应体系为25 μL：其中包括1.0 μL的正向引物，1.0 μL的反向引物，0.3 μL的探针，rehydration缓冲液14.75 μL，待测样本DNA或粗裂解产物2 μL，ddH₂O 4.7 μL；将上述23.75 μL混合物加入RPA-nfo反应管，充分混匀、溶解，最后加入1.25 μL 280 mM醋酸镁溶液，混匀后直接在37℃恒温水浴锅处理25 min。

8.如权利要求6所述的方法，其特征是：步骤（3）的具体步骤为：取RPA反应产物1 μL与49 μL LFD检测缓冲液混合，将LFD垂直浸入，5 min之内观察结果，若同时出现检测条带和对照条带，则该样品中牛支原体核酸阳性；仅出现对照条带则说明该样品中不含牛支原体核酸，如果仅出现检测条带或者无条带则说明检测不成立。

9.一种可快速有效检测出牛支原体成分的引物对及探针组合的筛选方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）检测样本DNA的提取或检测样本的现场裂解处理；

（2）以步骤（1）中处理的样本为模板，根据牛支原体的特异性的基因，设计多条特异性正向引物、反向引物和探针，进行RPA-nfo扩增；

（3）用LFD检测上述RPA-nfo扩增产物，根据检测结果判定样本中是否含有牛支原体。

10.下述任一应用，包括：

（1）权利要求1所述的引物对和探针组合在制备检测牛支原体的试剂盒、芯片、扩增反应试剂的应用；

（2）权利要求3~5中任一项所述的试剂盒在检测牛支原体中的应用；

（3）权利要求6~8中任一项所述的方法在检测牛支原体中的应用。